Base Editors y Prime Editors comienzan a hacer realidad su promesa clínica

El equipo científico de EmendoBio aprovecha las plataformas patentadas de la empresa para desarrollar terapias basadas en CRISPR de última generación. Se utiliza una plataforma de descubrimiento de nucleasas para ampliar el rango objetivo del genoma, y ​​se utiliza una plataforma de optimización específica del objetivo para permitir la edición de genes de alta precisión, incluida la edición específica de alelos, al tiempo que se mantienen altas eficiencias y se evitan los efectos fuera del objetivo. La compañía dice que puede diseñar nucleasas y guías de ARN a medida para muchas enfermedades que antes se consideraban incurables.

Por Mary Ann Labant

En 2016, un grupo de investigadores dirigido por David Liu, PhD, de Harvard, publicó un artículo en Nature que informaba sobre el desarrollo de la edición básica. La edición de bases, escribieron, es "un nuevo enfoque para la edición del genoma que permite la conversión directa e irreversible de una base de ADN objetivo en otra de manera programable, sin requerir la escisión de la columna vertebral del ADN de doble cadena o una plantilla de donante". Agregaron que la edición de base podría reducir el riesgo de mutaciones fuera del objetivo y tenía el potencial de "corregir de manera eficiente una variedad de mutaciones puntuales relevantes para la enfermedad humana".

Keiji Nishda, PhD, y sus colegas de la Universidad de Kobe realizaron un trabajo similar en ese momento. Muchos sistemas básicos de edición adicionales han sido desarrollados por investigadores académicos y comerciales en los años posteriores. Y eso no es todo. En 2019, se introdujo otro sistema de edición del genoma capaz de evitar roturas de ADN de doble cadena. Este sistema se llama edición principal y fue desarrollado, no por casualidad, por investigadores dirigidos por Liu.

"[La edición principal es] un método de edición del genoma versátil y preciso que escribe directamente nueva información genética en un sitio de ADN específico utilizando una endonucleasa Cas9 catalíticamente alterada fusionada con una transcriptasa inversa diseñada, programada con una guía de edición principal ARN (pegRNA) que especifica el sitio de destino y codifica la edición deseada", escribieron los investigadores en Nature. "La edición principal... tiene fortalezas y debilidades complementarias en comparación con la edición básica e induce una edición mucho más baja fuera del objetivo que la nucleasa Cas9 en sitios conocidos fuera del objetivo Cas9. La edición principal amplía sustancialmente el alcance y las capacidades de la edición del genoma y, en principio, podría corregir al 89% de las variantes genéticas conocidas asociadas con enfermedades humanas".

En la actualidad, se están desarrollando sistemas de edición básica y de edición principal para aplicaciones clínicas. Varios de estos sistemas se destacan en este artículo. Si bien estos sistemas son de última generación, o más bien vanguardistas, aún deben atender desafíos familiares, como el empaque y la entrega dirigida.

"Creemos que la edición principal es altamente específica y precisa porque la maquinaria de edición principal tiene que pasar por tres pasos de hibridación para realizar un cambio genético", dice Keith Gottesdiener, MD, presidente y director ejecutivo de Prime Medicine. "Es poco probable que aterrice en el lugar equivocado y desbloquee las tres llaves".

Según Gottesdiener, la edición principal puede corregir los 12 desajustes diferentes de un solo par de bases, reparar pequeñas mutaciones indel y eliminar y reemplazar grandes secuencias genómicas, todo de una manera programable. "En la edición programable, la edición está dirigida con precisión", enfatiza. "Podemos elegir, a un par de bases, donde queremos que ocurra una edición. Y dado que la maquinaria funciona y está guiada por un pequeño ARNg, podemos intercambiar eso y movernos a otro lugar en el genoma".

La edición principal funciona en una amplia gama de celdas inactivas o que se dividen rápidamente. Un tratamiento de una sola vez, el ADN se devuelve al tipo salvaje en el locus genético normal.

"Mejoramos y mejoramos la tecnología original", afirma Gottesdiener. "Es casi demasiado bueno para ser verdad". Advierte, sin embargo, que "llevar la tecnología a cualquier sitio presenta desafíos similares a los que otros ven". Las opciones familiares de entrega incluyen la electroporación para aplicaciones ex vivo; nanopartículas lipídicas (LNP) para dirigirse al hígado; y vectores de virus adenoasociados (AAV) para apuntar a otras ubicaciones estratégicas.

Prime Medicine tiene una amplia cartera de productos. Si bien una tubería de este tipo brinda a la empresa una variedad de opciones, también plantea un desafío de gestión. "Todas las indicaciones podrían avanzar a la clínica", señala Gottesdiener. "Sin embargo, algunos programas progresarán más rápido, algunos los asociaremos y otros serán eliminados".

En la tubería inicial, hay un énfasis en las indicaciones inmediatas y los programas de diferenciación. Prime seleccionó estas indicaciones después de equilibrar consideraciones como la genética definida, las prioridades médicas emergentes, los aportes de los socios líderes de opinión de Prime y los desafíos regulatorios y de entrega. El programa de diferenciación se centra en las características únicas de la enfermedad, como abordar las expansiones repetidas que se encuentran en la enfermedad de Huntington, una forma de esclerosis lateral amiotrófica y algunas formas de ataxia. Prime planea presentar una IND para su primera indicación, enfermedad granulomatosa crónica, en 2024.

Giuseppe "Pino" Ciaramella, PhD, presidente de Beam Therapeutics, observa que la edición básica modifica la tecnología basada en CRISPR de dos maneras fundamentales. En primer lugar, la edición de bases no necesita hacer rupturas de doble cadena, lo que puede conducir a reordenamientos genómicos y otras consecuencias no deseadas. En segundo lugar, la edición de bases generalmente fusiona la proteína CRISPR con una proteína humana adicional, una desaminasa que es capaz de convertir químicamente una nucleobase en otra directamente en el gen.

Una limitación de los editores de bases es que solo realizan ciertos tipos de ediciones de un solo par de bases. Es decir, solo pueden realizar mutaciones de transición (purina a purina o pirimidina a pirimidina), no mutaciones de transversión (purina a pirimidina o pirimidina a purina). No se pueden usar para realizar inserciones o eliminaciones o reemplazar cualquier tramo de ADN deseado. No obstante, debido a que son herramientas capaces de realizar mutaciones puntuales de transición con alta precisión y eficiencia, los editores de base tienen potencial en una variedad de aplicaciones terapéuticas.

La falta de rupturas de doble cadena confiere una ventaja significativa al permitir varias ediciones simultáneas. Un sistema que explota estas ediciones simultáneas es una plataforma Beam llamada Evasión emparejada de anticuerpos de células madre diseñadas (ESCAPE). Combina el acondicionamiento basado en anticuerpos con células madre hematopoyéticas editadas por genes multiplexados.

"Podemos hacer una edición destinada a modificar la enfermedad de células falciformes, así como una edición que haga que las células editadas sean resistentes a un anticuerpo a medida que puede dirigirse selectivamente a las células no editadas y crear un nicho en la médula ósea que permita que las células editadas se injerten siguiendo un trasplante", explica Ciaramella. Esto puede permitir un régimen de acondicionamiento no tóxico, a diferencia del régimen estándar de atención actual, que puede causar esterilidad y otros efectos secundarios.

La empresa utiliza tecnologías de entrega validadas clínicamente para entregar ARNm que codifica el editor. Los programas ex vivo usan electroporación y los programas in vivo encapsulan el ARNm en LNP que pueden dirigirse al hígado. Se están desarrollando nuevas formulaciones de LNP para dirigirse a otros tejidos, como las células inmunitarias o las células madre de la médula ósea.

El programa principal de Beam para la enfermedad de células falciformes, BEAM-101, es el primer programa de edición de bases clínicas de EE. UU. Ciaramella señala que el paquete regulatorio de Beam era consistente con el requerido para otros programas de edición de genes ex vivo.

Además de desarrollar su tecnología de edición básica, Beam colabora con otras empresas. A través de un acuerdo con Prime Medicine, Beam tiene el derecho exclusivo de desarrollar tecnología de edición principal para la creación o corrección de cualquier mutación de transición de base única, así como para el tratamiento de la enfermedad de células falciformes. Además, Beam está trabajando con Verve Therapeutics. En esta colaboración, Verve tiene acceso exclusivo a las tecnologías de edición básica, edición de genes y entrega de Beam para aplicaciones terapéuticas humanas contra ciertos objetivos cardiovasculares. Aunque Beam también tiene acceso a la tecnología de edición de ARN, la compañía, dice Ciaramella, no ha encontrado aplicaciones en las que la edición de ARN proporcione un beneficio sobre la edición de ADN.

El cardiólogo y científico Sekar Kathiresan, MD, destaca tres ideas sobre las enfermedades cardiovasculares que han surgido de la investigación genética humana. En primer lugar, si el nivel de colesterol en la sangre de una persona es bajo durante toda su vida, es muy poco probable que desarrolle un ataque al corazón. En segundo lugar, algunas personas resistentes a las enfermedades cardíacas portan mutaciones (mutaciones de resistencia) que naturalmente desactivan los genes que aumentan el colesterol. En tercer lugar, tres de las mutaciones de resistencia afectan la vía del colesterol de las lipoproteínas de baja densidad (LDL), cuatro de ellas afectan la vía del colesterol de las lipoproteínas ricas en triglicéridos (TRL) y una de ellas afecta la lipoproteína(a) (Lp(a)) vía del colesterol.

"La tecnología CRISPR nos permitió desarrollar un medicamento que imitaría estas mutaciones de resistencia natural", continúa Kathiresan. Por "nosotros" se refiere al equipo de desarrollo de Verve Therapeutics, la compañía de medicamentos genéticos de la que es cofundador y director ejecutivo. "Nuestros medicamentos de edición de genes de una sola vez", afirma, "están diseñados para reducir permanentemente el colesterol en la sangre".

VERVE-101, el producto candidato más avanzado de la empresa, se dirige al gen PCSK9 para reducir los niveles de colesterol LDL. VERVE-201, el siguiente producto candidato más avanzado de la empresa, se dirige al gen ANGPTL3 para reducir los niveles de colesterol TRL. Tanto el programa VERVE-101 como el VERVE-201 se basan en tecnología de edición básica. Para apuntar al gen LPA y reducir los niveles de colesterol Lp(a), Verve está diseñando un editor personalizado.

La entrega se beneficia del refinamiento. Los LNP estándar son pequeñas burbujas gordas que transportan carga. En el caso de VERVE-101, la carga es el ARNm para el editor base de CRISPR, así como un ARNg que dirige al editor al gen PCSK9. "Agregamos un ligando, una molécula de azúcar GalNAc, a un LNP estándar", dice Kathiresan. "Dado que el receptor GalNAc solo se expresa en los hepatocitos, un LNP GalNAc tiene el potencial de ser más potente y específico".

VERVE-101 se encuentra actualmente en un ensayo de Fase I, llamado corazón-1, para evaluar la seguridad y la eficacia en pacientes con hipercolesterolemia familiar heterocigota (HeFH), una forma genética de colesterol alto y enfermedad cardíaca prematura. Una enfermedad mórbida, la HeFH se caracteriza por niveles sanguíneos severamente elevados de colesterol LDL y enfermedad cardiovascular aterosclerótica prematura. Los regímenes actuales de píldoras diarias o inyecciones intermitentes para reducir el colesterol LDL suponen una pesada carga de tratamiento para los pacientes, los proveedores y el sistema de atención médica, y menos del 5 % de los pacientes con HFHe en todo el mundo alcanzan los niveles objetivo de colesterol LDL.

El ensayo heart-1 se está inscribiendo actualmente en Nueva Zelanda y el Reino Unido. Los datos clínicos se esperan para finales de este año. La compañía está trabajando con la FDA para abrir un IND en los Estados Unidos.

Las aplicaciones clínicas de la tecnología CRISPR-Cas9 deben demostrar seguridad y flexibilidad, dice David Baram, PhD, presidente y director ejecutivo de Emendo Biotherapeutics. La seguridad, sugiere, es en gran medida una cuestión de evitar efectos fuera del objetivo. "CRISPR-Cas9 apunta principalmente a lo que quieres que corte", dice Baram. "Pero sobre todo no es suficiente para la seguridad en su forma de tipo salvaje". Con respecto a la flexibilidad, enfatiza la necesidad de múltiples soluciones: "Para poder tratar la enfermedad de la manera más efectiva, una cartera de estrategias de edición permite apuntar a más enfermedades y loci en genes específicos".

Quizás la nucleasa más conocida en la edición de genes es la variante Cas9 aislada de la bacteria Streptococcus pyogenes (SpCas9). Sin embargo, existen miles de otras nucleasas, algunas de las cuales son superiores en actividad, número de sitios a los que pueden apuntar, especificidad y eficiencia de empaquetamiento. Un panel de nucleasas brinda la opción de encontrar la mejor nucleasa para tratar una enfermedad específica. "Nuestras nucleasas son muy activas y muy precisas, y pueden dirigirse al 90% del genoma humano", afirma Baram. "SpCas9 cubre menos del 10%".

Un equipo de expertos en computación y científicos genera el panel de nucleasas. La plataforma de ingeniería de la empresa luego adapta estas nucleasas de tipo salvaje para propósitos específicos. Un ejemplo es la edición específica de alelo de una enfermedad autosómica dominante en la que hay un alelo sano y un alelo mutado. "Podemos apuntar al alelo mutado incluso si tiene solo una pequeña diferencia de nucleótidos", afirma Baram. Esto ha abierto una ventana al tratamiento de enfermedades autosómicas dominantes en un solo paso.

La indicación principal de Emendo es la neutropenia congénita grave, un trastorno de la maduración de los neutrófilos que finalmente provoca una inmunodeficiencia, lo que hace que los pacientes sean muy susceptibles a las infecciones bacterianas. La terapia estándar para la enfermedad incluye inyecciones de factor estimulante de colonias de granulocitos, que pueden ayudar a restaurar la función del sistema inmunitario. Para tratar y, con suerte, curar la enfermedad, Emendo ha desarrollado una nueva estrategia de edición de genes ex vivo basada en CRISPR (OMNI A1), que implica la escisión específica de un alelo mutante causante de la enfermedad del gen ELANE. Emendo planea que esté en la clínica a fines de 2023.

También se está preparando un tratamiento para la hipercolesterolemia familiar. Este tratamiento consiste en dirigirse al gen LDLR (que codifica el receptor LDL) en lugar del gen PCSK9 (que codifica una proteína que regula la expresión del receptor LDL) para elevar el nivel de expresión del receptor LDL en la superficie de los hepatocitos y tomar el colesterol LDL del sangre a las células. La estrategia de edición elimina un elemento regulador en el gen LDLR que influye directamente en los niveles de expresión del receptor LDL en la superficie de la membrana. Los datos muestran que el uso del enfoque eleva los niveles de ingesta celular de LDL tres veces más que la eliminación de PCSK9 y la administración de estatinas combinadas.

La plataforma de edición base Pin-point™ de Revvity for Life Sciences incorpora los siguientes elementos: un ARNg; una nickasa (basada en Cas9 o una proteína similar para evitar la creación de roturas de ADN de doble cadena); y una desaminasa (u otra molécula efectora). El sistema se ensambla utilizando un aptámero en el ARNg y una proteína de unión al aptámero en la desaminasa u otra molécula efectora.

¿Qué distingue a la plataforma de edición base Pin-point de otros sistemas de edición base? Con la plataforma de edición de base Pin-point, la desaminasa y la nickasa no se fusionan entre sí. Se pueden intercambiar diferentes deaminasas y nickasas de forma independiente.

"Al usar un gRNA sin un aptámero, es posible apuntar a la función de corte de nCas9 para insertar secuencias de ADN en sitios específicos del genoma", explica Michelle Fraser, PhD, gerente de la unidad de negocios, Plataforma de edición de base Pin-point, Revvity para Ciencias de la Vida. "Esto permite la edición multiplex, provocando la desactivación de genes o la corrección de errores genéticos en el nivel de base única y también, al mismo tiempo, la inserción de genes".

La plataforma de edición de base Pin-point logró una conversión de base >75 % de C a T usando un editor de base de citosina en una edición multiplex de cuatro loci inmunogénicos diferentes (B2M, CD52, PDCD1 y TRAC) en células T. Los cuatro de estos loci fueron eliminados en más del 50% de las poblaciones de células editadas.

La plataforma de edición de base Pin-point también se usó para generar células T con receptor de antígeno quimérico (CAR) en las que se eliminaron estos mismos cuatro marcadores inmunogénicos y se incorporó el CAR dirigido a CD19. Un ensayo de destrucción de células tumorales confirmó que estos Las células CAR T fueron altamente efectivas. La edición de bases multiplex también se ha demostrado en células madre pluripotentes inducidas con una eficiencia similar.

La plataforma de edición base Pin-point se puede licenciar de Revvity for Life Sciences. Además, está disponible un servicio de detección en mosaico, en el que se utiliza la plataforma Pin-point para editar todos los residuos de C disponibles en un gen objetivo o genes de interés. Los fenotipos de las células editadas se utilizan luego para identificar dominios funcionales o caracterizar variantes genéticas sospechosas.

La gama de enzimas (variantes Cas, nickasas, desaminasas y otros efectores) se está expandiendo rápidamente a través de programas de descubrimiento de enzimas que buscan fuentes biodiversas, así como a través de ingeniería de proteínas en laboratorio y proyectos de evolución dirigida. Según Revvity for Life Sciences, la modularidad de la plataforma de edición base Pin-point brinda una oportunidad única para reemplazar la nickasa y/o la desaminasa con variantes recientemente desarrolladas.

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