Noqueando alfa | Liaoning Coastwise Partners Co., Ltd.

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9243 (2023) Citar este artículo

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La proteína asociada a la enfermedad de Parkinson (EP), la alfa-sinucleína (α-syn/SNCA), se expresa en gran medida en los melanomas agresivos. El objetivo de este estudio fue revelar los posibles mecanismos de participación de α-syn en la patogénesis del melanoma. Aquí, preguntamos si α-syn modula la expresión de las moléculas de adhesión pro-oncogénicas L1CAM y N-cadherina. Utilizamos dos líneas celulares de melanoma humano (SK-MEL-28, SK-MEL-29), clones de SNCA-knockout (KO) y dos líneas celulares de neuroblastoma SH-SY5Y humano. En las líneas de melanoma, la pérdida de expresión de α-syn dio como resultado disminuciones significativas en la expresión de L1CAM y N-cadherina y disminuciones significativas concomitantes en la motilidad. En promedio, hubo una reducción del 75 % en la motilidad en los cuatro SNCA-KO probados en comparación con las células de control. Sorprendentemente, al comparar las células de neuroblastoma SH-SY5Y que no tienen α-syn detectable con las células SH-SY5Y que expresan de forma estable α-syn (SH/+αS), descubrimos que la expresión de α-syn aumentó la L1CAM y la motilidad unicelular en un 54 %. y 597%, respectivamente. La reducción en el nivel de L1CAM en los clones de SNCA-KO no se debió a un efecto transcripcional, sino que encontramos que L1CAM se degrada de manera más eficiente en el lisosoma en los clones de SNCA-KO que en las células de control. Proponemos que α-syn favorece la supervivencia del melanoma (y posiblemente del neuroblastoma) porque promueve el tráfico intracelular de L1CAM a la membrana plasmática.

El melanoma es un cáncer de piel agresivo que surge de las células productoras de pigmento llamadas melanocitos. Estudios epidemiológicos han reportado la co-ocurrencia de melanoma y enfermedad de Parkinson (EP)1,2. Tal co-ocurrencia es inusual porque estas dos enfermedades son tan diferentes que el melanoma se caracteriza por una proliferación celular descontrolada, mientras que la EP se caracteriza por la muerte de las células neuronales. Los pacientes con melanoma tienen un riesgo de 1,5 a 1,85 veces mayor de desarrollar EP en comparación con los controles de la misma edad y sexo3,4 y, recíprocamente, los pacientes con EP tienen un riesgo de 1,4 a 20 veces mayor de desarrollar melanoma invasivo que un grupo de control5 ,6,7. El mecanismo de esta co-ocurrencia es desconocido y podría involucrar múltiples genes2, uno de los cuales es SNCA, e incluso factores ambientales. Aquí nos centramos en el papel de SNCA en el melanoma.

SNCA codifica la proteína alfa-sinucleína (α-syn)8,9,10, que se expresa en las neuronas11,12,13 y una variedad de otros tejidos14,15,16, incluidos los melanomas17, donde se expresa en gran medida. α-Syn es una pequeña proteína intrínsecamente desplegada que en las neuronas se localiza en las terminales nerviosas donde se acoplan las vesículas sinápticas18; acelera la cinética de eventos exocitósicos individuales19. No se sabe si α-syn promueve la exocitosis en otros tipos de células. Se han atribuido muchas otras actividades a esta proteína única porque, en su multitud de conformaciones, se une a muchas biomoléculas, es decir, fosfolípidos20,21, proteínas22,23,24 y ADN25 cargados negativamente. Por lo tanto, mientras que α-syn funciona en el sistema endolisosomal para promover la endocitosis y la exocitosis19,26, puede tener otras funciones. La naturaleza intrínsecamente desplegada de α-syn hace que sea muy propensa a agregarse en conformaciones amiloidogénicas oligoméricas y similares a priones27, y algunos de estos agregados desencadenan la neurodegeneración en la EP28. Paradójicamente, se ha sugerido que los agregados priónicos de α-syn promueven la autofagia en las células de melanoma29, lo que favorece la supervivencia. Si α-syn tiene otras funciones favorables a la supervivencia en el melanoma es el tema de este estudio.

Dos estudios evaluaron el efecto de eliminar SNCA en la homeostasis celular. Primero, la eliminación de SNCA en células epiteliales de retina de ratón in vitro disminuyó significativamente el nivel del receptor de transferrina (TfR1) y su transcrito de ARNm, y la sobreexpresión de α-syn aumentó los niveles de la proteína TfR1 y su transcrito de ARNm en relación con las células de control30,31 . La pérdida de expresión de α-syn en las células epiteliales de la retina hizo que las moléculas de TfR1 se acumularan en las vesículas de Golgi, lo que sugiere que se requiere α-syn para la vía que transita TfR1 desde el trans-Golgi hasta la membrana plasmática30. En segundo lugar, se eliminó SNCA en la línea celular de melanoma cutáneo humano, SK-MEL-28, y los clones de SNCA-KO se evaluaron in vitro y en un modelo de xenoinjerto de ratón31. La pérdida de expresión de α-syn en estas células de melanoma disminuyó los niveles de TfR1 y el exportador de hierro ferroportina y suprimió significativamente el crecimiento de los tumores SNCA-KO injertados en ratones desnudos. La reducción en el nivel de TfR1 en los clones SNCA-KO fue una consecuencia de su degradación lisosomal mejorada. Los resultados de estos dos estudios son consistentes con que α-syn promueve el tráfico vesicular de TfR1.

En este estudio, buscamos determinar si el nivel de expresión de α-syn afecta el nivel de expresión de las proteínas de adhesión. Específicamente, dado que TfR1 y L1CAM, que es una proteína de adhesión expresada en neuronas y melanomas, colocalizan tras la endocitosis en células 3T332, preguntamos si α-syn modula la expresión de L1CAM, como lo hace TfR1. Con este fin, medimos los niveles de L1CAM en células de melanoma y neuroblastoma con o sin expresión de α-syn. Además, también evaluamos los niveles de E-, N-cadherina y vimentina, que son tres proteínas involucradas en la transición epitelial a mesenquimatosa (EMT)33,34. La EMT es una transición altamente regulada donde las células epiteliales se despojan de sus marcadores epiteliales y morfología y se convierten en un fenotipo mesenquimatoso. Sin embargo, debido a que los melanocitos (y los melanomas) no son células epiteliales, es un nombre inapropiado decir que los melanocitos se someten a una EMT. Mostramos que la eliminación de α-syn en líneas celulares de melanoma y la baja expresión de α-syn en una línea celular de neuroblastoma causan disminuciones significativas en L1CAM en comparación con las células de control que expresan α-syn. Nuestra interpretación de estos hallazgos es que α-syn es un factor favorable a la supervivencia en el melanoma porque actúa después de la traducción para mantener altos niveles de L1CAM y, a su vez, altos niveles de motilidad.

Las líneas celulares utilizadas en este estudio se proporcionan en la Tabla 1. Cada línea celular de melanoma alberga la mutación BRAF V600E35, que es la mutación más común en el melanoma cutáneo (Tabla 1). Esta mutación provoca la activación constitutiva de la vía de señalización RAS-RAF-MEK-ERK36, lo que conduce a la proliferación. Las células SH-SY5Y, que se utilizan ampliamente para estudiar PD37, se derivan de un neuroblastoma.

Examinamos las células de control SK-MEL-28 y sus derivados (Tabla 1). Los niveles de E-cadherina, L1CAM, N-cadherina, vimentina, α-syn y α-tubulina se probaron en extractos celulares mediante transferencia Western (Fig. 1A-D; Figs. complementarias S1 y S2). Las intensidades de banda normalizadas de un análisis densitométrico de las transferencias se muestran en la Fig. 1E. En comparación con las células de control SK-MEL-28, en dos clones KO, L1CAM, N-cadherina y vimentina se regularon a la baja en un 26 % (P = 0,002), 35 % (P = 0,005) y 52 % (P = 0,008). ), respectivamente. Por el contrario, el nivel de E-cadherina no se vio afectado (Fig. 1E). Los clones KI8 y KI9 exhibieron niveles de estas tres proteínas como las células de control.

La pérdida de α-syn disminuye los marcadores similares a EMT y la motilidad en las células SK-MEL-28. (A–D) Western blots representativos de E-Cad, L1CAM, N-Cad, vimentina, α-syn y α-tubulina en lisados de células de control, KO y KI cultivadas in vitro. (E) Análisis cuantitativo de los niveles relativos de proteínas. Las intensidades de las bandas de E-Cad, L1CAM, N-Cad y vimentina se normalizan a α-tubulina. Todos los experimentos se repitieron con al menos tres réplicas biológicas (n = 3). (F) Imágenes representativas de microscopio óptico de pistas fagocinéticas creadas por células de control, KO8 y KI8 en pocillos recubiertos de oro coloidal. Las flechas negras marcan las pistas fagocinéticas individuales en las respectivas líneas celulares. Las imágenes se adquirieron usando un objetivo ×10 y el área fagocinética despejada por celda se midió usando el software ImageJ. (G) Los gráficos de barras muestran la cuantificación de las áreas despejadas de tres experimentos independientes. Se eligieron aleatoriamente al menos 33 pistas por condición experimental para la cuantificación. Se utilizaron 100 pistas para n = 3 por grupo experimental para el análisis estadístico. (E,G) Los valores son la media ± sd **, p = 0,0015–0,0027; *, p = 0,0073–0,0134 determinado mediante ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Dunnett.

Dado que los clones SNCA-KO expresan niveles más bajos de L1CAM, N-cadherina y vimentina, que están relacionados con la invasión y la migración, preguntamos si los clones KO son menos móviles que las células de control. Con este fin, utilizamos un ensayo de motilidad de una sola célula de oro coloidal38 para monitorear el movimiento de las células individuales. A medida que una celda se mueve por la superficie de un portaobjetos cubierto con oro coloidal, la celda deja un rastro donde hay menos oro en la superficie. Las imágenes representativas del movimiento de las células de control, KO8 y KI8 se muestran en la Fig. 1F, mientras que las de control, KO9 y KI9 se muestran en la Fig. S3 complementaria. Las células de control crearon pistas mucho más grandes que los clones de KO8, y el patrón de pistas de los clones de KI8 fue como el de las células de control. ImageJ se utilizó para medir el área de las pistas, y los resultados se representan en la Fig. 1G. La pérdida de la expresión de α-syn disminuyó significativamente la motilidad unicelular de KO8 y KO9 en un 69 % (P < 0,0001) y un 73 % (P < 0,0001), respectivamente, y la reexpresión de α-syn restauró la motilidad al nivel del células de control

El potencial de invasión y migración de las células de control SK-MEL-28, SNCA-KO y SNCA-KI se determinó mediante ensayos Transwell utilizando cámaras de Boyden39. El ensayo de invasión mide la capacidad de las células en medios sin suero en la cámara superior para invadir el matrigel y pasar a la cámara inferior con medios completos que contienen FBS. El ensayo de migración utiliza la misma configuración pero sin matrigel. Después de 24 h, las células de la cámara inferior se fijaron, se tiñeron con cristal violeta, se tomaron imágenes mediante microscopía óptica y se contaron. Las imágenes representativas del ensayo de migración que comparó el control, KO8 y KI8 se muestran en la Fig. 2A; las imágenes para control, KO9 y KI9 se muestran en la figura complementaria S3. El número de células migradas por campo mostró una disminución significativa del 77 % (P < 0,0001) para las células KO8 en comparación con las células de control, y KI8 exhibió el mismo nivel de células migradas por campo que las células de control (Fig. 2A, lado izquierdo). trama). Se encontraron resultados similares para los clones KO9 y KI9 (Fig. 2A, gráfico de la derecha). Las imágenes representativas del ensayo de invasión que compararon el control, KO8 y KI8 se muestran en la Fig. 2B; las imágenes para control, KO9 y KI9 se muestran en la figura complementaria S3. El número de células invadidas por campo mostró una disminución significativa del 77 % (P < 0,0001) para las células KO8 en comparación con las células de control, y KI8 exhibió el mismo nivel de células migradas que las células de control (Fig. 2B, gráfico de la izquierda). Se obtuvieron resultados similares para los clones KO9 y KI9 (Fig. 2B, gráfico de la derecha).

SNCA-KO reduce la migración y la invasión en células SK-MEL-28 según lo evaluado por el ensayo de cámara Transwell. En el ensayo de migración, se sembraron 1 × 105 células en medios sin suero en la cámara superior del aparato transwell (poro de 8 μm) y se les permitió migrar a través de la membrana hacia la cámara inferior. En el ensayo de invasión, se añadieron 50 µl de matrigel (0,2 mg/ml) para formar una fina capa de gel antes del ensayo, y luego se sembraron 4 × 105 células en medio sin suero en la cámara superior y se permitió que invadieran la membrana. en la cámara inferior. En ambos experimentos, el medio completo DMEM con FBS al 50 % en la cámara inferior sirvió como quimioatrayente. Las células que atravesaron la membrana se fijaron sobre la membrana con paraformaldehído y se tiñeron con cristal violeta. (A) Imágenes representativas de células de control migradas, KO8 y KI8 (después de 24 h) por campo de 10x. Se seleccionaron al azar un total de tres campos microscópicos de cada membrana interna y las células se contaron y representaron en un gráfico (n = 3 experimentos independientes). (B) Imágenes representativas de células de control invadidas, KO8 y KI8 (después de 24 h) por campo de 10x. Se seleccionaron al azar un total de tres campos microscópicos de cada membrana interna, y las células se contaron y representaron en gráficos (n = 3 experimentos independientes). Los valores son valores P medios ± sd determinados mediante un ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Dunnett.

A continuación, preguntamos por qué el nivel de L1CAM es significativamente menor en las células SNCA-KO en relación con las células de control. Nos centramos en L1CAM porque (i) L1CAM y α-syn se han implicado en la plasticidad sináptica40. (ii) L1CAM se reconoce como un antígeno tumoral implicado en la motilidad41,42,43. (iii) L1CAM se somete a endocitosis con TfR1 en células de fibroblastos 3T332. (iv) Las moléculas de TfR1 se degradan de manera más eficiente en el lisosoma en las células SNCA-KO en comparación con las células de control31. Presumimos que α-syn promueve el tráfico eficiente de vesículas endocíticas que contienen L1CAM hacia y desde la membrana plasmática; en consecuencia, en ausencia de α-syn, una gran proporción de vesículas endocíticas que contienen moléculas L1CAM no logran alcanzar la membrana plasmática y, en cambio, se derivan al lisosoma para su degradación. Al menos cuatro vías conducen al lisosoma44,45: (i) vía del endosoma al lisosoma, (ii) vía fagocítica, (iii) vía de la autofagia al lisosoma (macroautofagia) y (iv) autofagia mediada por chaperonas. Dado el diseño de los siguientes experimentos, postulamos que investigamos la vía del endosoma al lisosoma, aunque también monitoreamos un marcador de autofagia.

Probamos la degradación de las moléculas L1CAM en el lisosoma con el inhibidor bafilomicina A1 (baf)46. Baf evita la acidificación del lisosoma, por lo que las proteasas lisosomales, que requieren un pH bajo para su actividad, están inactivas. Las vesículas aún pueden fusionarse con los lisosomas en las células tratadas con baf, pero sus proteínas de carga no pueden degradarse. Si, en ausencia de expresión de α-syn, las vesículas endocíticas que contienen moléculas L1CAM se desvían hacia el lisosoma para su degradación, entonces baf debería bloquear dicha degradación; por tanto, el nivel de L1CAM en las células SNCA-KO tratadas con baf debería ser el mismo que en las células de control. Las células se trataron durante 5 h con dimetilsulfóxido (DMSO) o baf. Los lisados celulares se probaron para L1CAM, LC3-I y -II, α-syn y α-tubulina mediante transferencia Western (Fig. 3A; Figs. Suplementarias S4 y S5). LC3-II, que es una forma lipidada de LC3, se acumula en los autofagosomas si se inhibe la autofagia. Las intensidades de las bandas se cuantificaron mediante densitometría y los datos resultantes se normalizaron y analizaron de dos formas.

La pérdida de α-syn promueve la degradación lisosomal de L1CAM. (A) Análisis de transferencia Western de los niveles de L1CAM, LC3-I y -II, α-syn y α-tubulina en lisados de control, células KO y KI, que habían sido tratadas durante 5 h con DMSO o baf. Las células indicadas se trataron con baf 50 nM durante 5 h y los lisados se sondearon en busca de las proteínas indicadas. Las intensidades de las bandas se cuantificaron por densitometría. Este experimento se realizó en n = 3 réplicas biológicas. (B) Gráfico del nivel de L1CAM en lisados de células no tratadas (DMSO) frente a células tratadas (baf). En este gráfico, L1CAM (L1) se normalizó a α-tubulina (tub), según (IL1/Itub), donde IL1 e Itub son las intensidades promedio de las respectivas bandas. Los valores de p se determinaron mediante una prueba t de Student unilateral. (C) Gráfico del nivel de L1CAM comparado por grupo de tratamiento. En este gráfico, L1CAM se normalizó a α-tubulina, según el control de muestra (IL1/Itub) (Itub/IL1). Los valores de P se determinaron mediante un ANOVA unidireccional con la prueba post hoc de Dunnett. (D) Análisis cuantitativo de RT-PCR de L1CAM. Los niveles relativos de ARNm en el cambio de pliegue de L1CAM y SNCA se normalizaron al gen de limpieza GAPDH. Los valores de p se determinaron mediante ANOVA unidireccional, post hoc de Dunnett (n = 3). Los valores en las parcelas (B–D) son medias ± sd

Primero, comparamos el nivel de L1CAM en células no tratadas versus tratadas usando una prueba t unilateral. Un tratamiento con baf de 5 h no logró aumentar L1CAM en el control y en los dos clones KI (Fig. 3B). Por el contrario, el tratamiento con baf aumentó L1CAM en un 70 % (P = 0,02) y un 47 % (P = 0,14) en los clones KO8 y KO9, respectivamente. Estos resultados muestran que durante un período de 5 h se degradó un número significativo de moléculas L1CAM en el lisosoma del clon KO8 pero no en las células de control, clones KO9 y KI.

En segundo lugar, comparamos los niveles de L1CAM en el grupo no tratado y por separado en el grupo tratado con baf. En este análisis, los niveles de L1CAM en los clones KO y KI se normalizaron con respecto a las células de control. En el grupo de DMSO, la expresión de L1CAM en cada uno de los clones de SNCA-KO disminuyó en promedio un 50 % (P = 0,022–0,024) en relación con las células de control (Fig. 3A, carriles 2 y 4 frente a 1; Fig. 3C) . Por el contrario, en el grupo baf, L1CAM no mostró una disminución significativa en los clones KO en relación con las células de control (Fig. 3A, carriles 8 y 10 frente a 7; Fig. 3C).

Los experimentos de control adicionales fueron como sigue. Aunque L1CAM es una proteína de membrana y las proteínas de membrana se degradan en el lisosoma, verificamos que L1CAM no está sujeto a degradación proteasómica utilizando el inhibidor de proteasoma MG132 (Fig. S6 complementaria). También llevamos a cabo una PCR cuantitativa (qPCR) para verificar el nivel de ARNm de L1CAM en los clones de control y KO. No se encontraron pruebas de una disminución del ARNm de L1CAM en las células KO8 y KO9 en comparación con las células de control. En cambio, se detectó un modesto aumento en esta transcripción en los clones KO (Fig. 3D). Los resultados combinados son consistentes con una disminución en el nivel de L1CAM en las células SNCA-KO debido a la degradación de la proteína en el lisosoma.

Eliminamos SNCA en la línea celular cutánea humana SK-MEL-29 y usamos las células parentales y dos clones de SNCA-KO (Tabla 1) en los siguientes experimentos. Se usó transferencia Western para sondear la expresión de L1CAM, N-cadherina, vimentina, α-syn y α-tubulina en extractos celulares (Fig. 4A, B; Fig. S7 complementaria, transferencias sin recortar). La pérdida de la expresión de α-syn provocó una disminución del 20 % en la expresión de L1CAM en ambos clones de SNCA-KO en comparación con las células de control (Fig. 4A, C), una disminución del 20 % en la N-cadherina (Fig. 4A, D), pero sin cambios en la vimentina (Fig. 4B, E). Aunque las disminuciones en la expresión de L1CAM y N-cadherina fueron modestas, tres de los cuatro cambios fueron estadísticamente significativos. También realizamos el ensayo de motilidad unicelular de oro coloidal en células parentales SK-MEL-29 y dos clones SNCA-KO. Las células de control tenían una motilidad mucho mayor que cualquiera de los dos clones KO, y las imágenes de las pistas para el control y KO1 se muestran en la Fig. 4 F, y las pistas para KO2 se muestran en la Fig. S7 complementaria. El gráfico del área cuantificada de las pistas de células individuales mostró una disminución del 80 % en la motilidad (P < 0,0001) para cada clon KO (Fig. 4G).

La pérdida de α-syn disminuye L1CAM y N-cadherina y la motilidad en las células SK-MEL-29. (A) Transferencias Western representativas de L1CAM, N-Cad, α-syn y α-tubulina en lisados del control y células α-syn KO cultivadas in vitro. (B) Transferencias de Western representativas de vimentina, α-syn y α-tubulina. Datos cuantitativos que muestran los niveles relativos de proteína de L1CAM (C), N-Cad (D) y vimentina (E) normalizados a α-tubulina. Todos los experimentos se repitieron con al menos tres réplicas biológicas (n = 3). (F) Se adquirieron imágenes de microscopio de campo claro representativas de pistas fagocinéticas creadas por control y células KO α-syn en pocillos recubiertos de oro coloidal utilizando un microscopio óptico con un objetivo ×10. Las pistas fagocinéticas individuales representadas por marcas de flechas negras se midieron utilizando el software ImageJ y se representaron en (G) Se eligieron aleatoriamente al menos 33 pistas por condición experimental para la cuantificación. Se utilizó un total de 100 pistas para n = 3 por grupo experimental para el análisis estadístico. Los valores en las parcelas (C–E, G) son la media ± sd Los valores P se determinaron mediante un ANOVA unidireccional, prueba post hoc de Dunnett.

Dado que la pérdida de la expresión de α-syn disminuye la L1CAM, la N-cadherina y la motilidad celular en dos líneas celulares de melanoma, nos preguntamos si sería cierto lo contrario: ¿la expresión de α-syn en células que carecen de expresión de α-syn aumenta la expresión de proteínas de adhesión prooncogénicas y, al mismo tiempo, aumentan la motilidad celular? Para probar esta idea, utilizamos la línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y, que no tiene α-syn detectable, y células SH-SY5Y (SH/+αS) que expresan de forma estable α-syn de tipo salvaje (Tabla 1). Los niveles de L1CAM, N-cadherina, vimentina, α-syn y GAPDH en los extractos celulares se probaron mediante transferencia Western (Fig. 5A; Fig. S8 complementaria, transferencias sin recortar), lo que arrojó los siguientes resultados. Primero, α-syn se expresó de manera robusta en las células SH/+αS pero no en la línea parental (Fig. 5A, panel 4). En segundo lugar, el nivel de L1CAM fue un 54 % (P = 0,044) más alto en las células SH/+αS que en las células parentales (Fig. 5A, panel 1; Fig. 5B). En tercer lugar, los niveles de N-cadherina fueron similares en las dos líneas celulares (P = 0,508) (Fig. 5A, panel 3; Fig. 5B). En cuarto lugar, el nivel de vimentina fue un 415 % (P = 0,001) más alto en las células SH/+αS que en las células parentales (Fig. 5A, panel 2; Fig. 5C).

La expresión de α-syn en células SH-SY5Y aumenta L1CAM y la motilidad. (A) Western blots representativos de L1CAM, vimentina, N-Cad, α-syn y α-tubulina en lisados de control y células SH/αS cultivadas in vitro. Los análisis cuantitativos que representan los niveles relativos de proteína se midieron normalizando las intensidades de banda de L1CAM y N-Cad (B) y vimentina (C) a α-tubulina. Todos los experimentos se repitieron con al menos tres réplicas biológicas (n = 3–6). (D) Imágenes de microscopio de campo claro representativas de pistas fagocinéticas creadas por control y células SH-SY5Y que sobreexpresan α-syn en pocillos recubiertos de oro coloidal. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio óptico con un objetivo de ×10. Las pistas fagocinéticas individuales representadas por marcas de flechas negras se midieron utilizando el software ImageJ y se representaron en (E). Se eligieron aleatoriamente al menos 33 pistas por condición experimental para la cuantificación. Se utilizó un total de 100 pistas para n = 3 por grupo experimental para el análisis estadístico. Los valores en las gráficas (B,C,E) son la media ± sd Los valores P se determinaron mediante una prueba t de Student bilateral.

También se midió la motilidad unicelular de las dos líneas celulares SH-SY5Y. Las células SH / + αS exhibieron una motilidad unicelular robusta durante el período de incubación de 24 h en comparación con las células parentales (Fig. 5D). El gráfico del área cuantificada de las huellas de células individuales muestra que la expresión de α-syn en las células SH-SY5Y aumentó significativamente la motilidad de dichas células individuales en comparación con las células de control. Sorprendentemente, las células SH/+αS mostraron un aumento del 597 % (P < 0,0001) en la motilidad de una sola célula en comparación con las células parentales (Fig. 5E).

Los experimentos clásicos realizados hace 40 años dieron una excelente explicación de la cinética de la internalización de la transferrina y el receptor de la transferrina en una línea celular de hepatoma humano 47,48. Uno de estos grupos incluso propuso un modelo de internalización y reciclaje que tiene una ruta predeterminada hacia el lisosoma48. Su modelo es un modelo excelente para el presente trabajo (ver Fig. 7 de la ref. 48). Ahora sabemos que TfR y L1CAM tienen cada uno una secuencia de reciclaje endocítica citosólica 32,49, cada uno se une a AP-2, que es una proteína adaptadora de clatrina que se une a la secuencia de reciclaje, cada uno sufre endocitosis mediada por clatrina 32,50 y colocalizar durante la internalización mediada por clatrina32, como se captura en el modelo de la Fig. 6A.

Modelo propuesto y simulaciones del efecto de α-syn en el reciclaje del receptor. (A) Panel izquierdo: modelo en el que α-syn acelera el tráfico de vesículas internalizadas que contienen L1CAM y TfR hacia la membrana plasmática. Panel derecho: modelo donde la pérdida de expresión de α-syn da como resultado menos L1CAM y TfR en la membrana plasmática. (B) Reacciones propuestas que modelan el tráfico de vesículas. Ro, Ri y Rlys son una molécula receptora en la superficie celular, en una vesícula internalizada y en el lisosoma, respectivamente. α-syn puede afectar diferencialmente estas tres reacciones. Consulte los resultados de la simulación en el archivo de simulaciones complementarias. (C) La gráfica muestra el porcentaje de Ro y Rlys después de 180 min de simulación para las siguientes reacciones. Caso +α-syn: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,005 min−1. caso −α-syn: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,1 min−1, k2 = 0,005 min−1. (D) La gráfica muestra el porcentaje de Ro y Rlys después de 180 min de simulación para las siguientes reacciones. + caso α-syn: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,005 min−1. caso −α-syn: k1 = 0,1 min−1, k−1 = 0,5 min−1, k2 = 0,02 min−1.

Intentamos comprender cómo α-syn afecta el tráfico de receptores mediante la realización de simulaciones. Basado en este trabajo previo sobre el tráfico de TfR, el modelo más simple para la disminución de L1CAM y TfR en células SNCA-KO en relación con las células de control son las dos reacciones (también mostradas en la Fig. 6B),

donde Ro, Ri y Rlys son el receptor unido a la membrana plasmática, el receptor internalizado en las vesículas y el receptor en el lisosoma, respectivamente. Proponemos que la Ec. (1) puede ser modelado por moléculas pequeñas que reaccionan en solución de acuerdo con

Espenson51 resolvió las ecuaciones diferenciales asociadas con las reacciones en la ecuación. (2), y usamos esas soluciones para probar el papel de α-syn en el tráfico de receptores en dos simulaciones (consulte "Materiales y métodos" para obtener más detalles), de la siguiente manera.

Estipulamos que α-syn acelera la fusión de vesículas internalizadas con la membrana plasmática (Ri → Ro) más de lo que acelera la endocitosis (Ro → Ri), es decir, k-1 > k1. Esta sería una forma obvia de aumentar o mantener el número de receptores en la superficie celular. En este modelo, la pérdida de la expresión de α-syn disminuiría la velocidad a la que las vesículas internalizadas se fusionan con la membrana plasmática. Para simular esta acción catalítica propuesta de α-syn, se realizó una simulación con k-1 = 0,5 min−1 y k1 = 0,1 min−1; mientras que la otra simulación donde la expresión α-syn está ausente se realizó con k−1 = k1 = 0,1 min−1 (en cada una de estas simulaciones, k2 = 0,005 min−1). Estas simulaciones revelaron que perder α-syn disminuye la cantidad de receptores en la superficie celular (72 % → 33 %) y aumenta la cantidad en el lisosoma (14 % → 35 %) (Fig. 6C).

Estipulamos que α-syn inhibe la transferencia de vesículas internalizadas al lisosoma (Ri → Rlys). De ello se deduce que la pérdida de la expresión de α-syn aumentaría la tasa de transferencia de vesículas internalizadas al lisosoma. Para simular la acción inhibidora propuesta de α-syn, se realizó una simulación con k2 = 0,005 min−1; mientras que la otra simulación donde la expresión α-syn está ausente se realizó con k2 = 0,02 min−1 (en cada una de estas simulaciones, k−1 = 0,5 min−1 y k1 = 0,1 min−1). Estas simulaciones muestran que perder α-syn disminuye la cantidad de receptores en la superficie celular (72% → 47%) y aumenta la cantidad de receptores transferidos al lisosoma (14% → 44%) (Fig. 6D). En general, nuestras simulaciones muestran que α-syn puede alterar el número de moléculas L1CAM y/o TfR en la superficie celular de dos maneras muy diferentes.

Los principales hallazgos de este informe son que (i) la pérdida de expresión de α-syn en dos líneas celulares de melanoma cutáneo humano disminuye significativamente L1CAM, N-cadherina y la motilidad celular (Figs. 1B, C, E, 4A, C, G) ). (ii) La pérdida de expresión de α-syn estimula la degradación de L1CAM en el lisosoma (Fig. 3). (iii) Un aumento en la expresión de α-syn en las células SH-SY5Y aumenta L1CAM y la motilidad celular (Fig. 5A, B, D, E).

L1CAM es una glicoproteína transmembrana de 200–220 kDa que es un miembro de la superfamilia de las inmunoglobulinas que tiene una miríada de actividades en el sistema nervioso adulto, incluido el crecimiento de neuritas, la migración, la adhesión y la diferenciación neuronal (para revisiones, consulte 52,53,54) . L1CAM se ha implicado en la plasticidad sináptica52 y, curiosamente, α-syn se ha implicado en la plasticidad sináptica40. L1CAM, que se regula positivamente en varios cánceres de origen neuroectodérmico y de la cresta neural55, incluidos los melanomas, se reconoce como un antígeno tumoral implicado en la motilidad41,42,43. Ernst et al. descubrió que la eliminación de L1CAM reduce significativamente la metástasis en un modelo de xenoinjerto de melanoma humano56. En este documento, encontramos que la eliminación de SNCA reduce significativamente el nivel de L1CAM en relación con las células de control que expresan α-syn, y la disminución del nivel de esta proteína de adhesión probablemente contribuye a la reducción de la motilidad celular en dos líneas celulares de melanoma y una célula de neuroblastoma. línea.

Las simulaciones muestran que α-syn puede aumentar (o mantener) la cantidad de L1CAM o TfR en la superficie celular al promover el tráfico o la fusión de vesículas con la membrana plasmática o al inhibir la fusión de vesículas internalizadas con el lisosoma (Fig. 6). En teoría, es posible que α-syn pueda aumentar (o mantener) la cantidad de L1CAM y TfR en la superficie celular al inhibir la endocitosis, pero dado que se ha demostrado que la sinucleína promueve la endocitosis26, rechazamos la idea de que la sinucleína actuaría inhibiendo la endocitosis. Claramente, se necesitan experimentos de microscopía de alta resolución de TfR marcado o L1CAM marcado en células con y sin expresión de α-syn para descifrar la reacción o reacciones específicas afectadas por α-syn.

Turriani y colegas29 sugirieron recientemente que "existe un vínculo molecular inverso entre la EP y el melanoma y que las proteínas que son "jugadores perjudiciales" en la EP son "jugadores beneficiosos" en el melanoma porque sus funciones confieren beneficios de supervivencia significativos al melanoma primario y metastásico". Turriani demostró que el compuesto anle128b, que interrumpe los oligómeros priónicos de α-syn29, protege a las neuronas de la muerte celular inducida por α-syn, pero, por el contrario, este compuesto promueve la muerte celular masiva de la línea celular de melanoma WM983-B. El tratamiento de las células WM983-B con anle138b resultó en niveles reducidos de α-syn agregado, cambios morfológicos y alteraciones en el potencial de la membrana mitocondrial y la autofagia. Se concluyó que la disolución de formas agregadas similares a priones de α-syn desregula la autofagia, lo que sugiere que estas formas agregadas inusuales de α-syn promueven la autofagia. Nuestro estudio y el estudio de Turriani son bastante diferentes, ya que Turriani comparó células de melanoma que contenían formas agregadas de α-syn parecidas a priones con las mismas células en las que se disolvieron los agregados; mientras que comparamos las células de melanoma que expresan α-syn con las que no lo hacen. Por otro lado, cada estudio convergió de forma independiente en el sistema endolisosomal, es decir, cómo la sinucleína afecta la actividad de los lisosomas y el tráfico endolisosomal. Se necesita más trabajo para descifrar el papel de α-syn en el melanoma.

Las cadherinas E y N son glicoproteínas transmembrana de adhesión célula-célula dependientes de Ca++57. Las colas citoplasmáticas conservadas de estas dos proteínas interactúan con redes de proteínas involucradas en diferentes vías de señalización celular. El ectodominio de E-cadherina forma dímeros homotípicos con las células vecinas. La N-cadherina tiene una estructura similar a la E-cadherina, pero su cola citoplásmica interactúa con un conjunto diferente de proteínas58. Una de las características de la EMT es la regulación al alza de la N-cadherina seguida de la regulación a la baja de la E-cadherina58. En nuestras manos, eliminar la expresión de α-syn en las dos líneas celulares de melanoma disminuyó significativamente el nivel de N-cadherina pero no de E-cadherina (Figs. 1A, C, E, 4A, C, D). Es como si la pérdida de expresión de α-syn revirtiera parcialmente un fenómeno 'similar a EMT'.

Células epiteliales tubulares renales, ratones knockout condicionales y muestras clínicas de tejido renal humano se utilizaron recientemente para evaluar el papel de la α-syn epitelial tubular renal en la fibrosis renal59. Bozic y sus colegas encontraron que el tratamiento de las células renales HK-2 con el factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1), que media la señalización de la fibrosis en las células epiteliales renales, cambió el fenotipo epitelial (pérdida de la morfología de los adoquines), disminuyó la E-cadherina y aumentó alfa-actina de músculo liso (α-SMA) y vimentina. TGF-β1 indujo concomitantemente una disminución dependiente de la dosis en el ARNm de SNCA y la expresión de α-syn. Dada la concurrencia de la pérdida del fenotipo epitelial y la desregulación de la expresión de α-syn, los autores plantearon la hipótesis de que α-syn tiene un papel en el mantenimiento del fenotipo epitelial de las células epiteliales tubulares proximales renales (RPTEC) in vitro. Su hipótesis fue respaldada por su descubrimiento de que la sobreexpresión de α-syn en células HK-2 inhibía los aumentos inducidos por TGF-β1 en α-SMA y vimentina in vitro. Continuaron demostrando que α-syn modula la activación de ERK1/2, Akt y p38 in vitro, que TGF-β1 disminuye la expresión de α-syn a través de la activación del eje MAPK-p38, y que la pérdida de α-syn acelera el gen profibrótico expresión. Nuestro grupo había demostrado anteriormente que α-syn inhibe la fosforilación inducida por estrés de p38 (y JNK y c-Jun) en células SH-SY5Y60. Su conclusión fue que α-syn desempeña un papel en el mantenimiento del fenotipo epitelial de las RPTEC. Por supuesto, es difícil comparar nuestros resultados con los de Bozic porque usamos células cancerosas no derivadas del epitelio, mientras que Bozic usó células epiteliales renales que no se dividen. Por otro lado, estos dos estudios revelan la naturaleza similar al Dr. Jekyll y al Sr. Hyde de α-syn: α-syn admite un fenotipo epitelial de células renales, mientras que admite un fenotipo 'mesenquimatoso' de melanoma y neuroblastoma. células.

En resumen, hemos demostrado que la pérdida de expresión de α-syn en dos líneas celulares de melanoma cutáneo humano da como resultado disminuciones significativas en dos proteínas de adhesión, L1CAM y N-cadherina, y disminuciones significativas concomitantes en la motilidad. Proponemos que α-syn favorece la supervivencia del melanoma (y probablemente del neuroblastoma) porque promueve el tráfico vesicular eficiente de L1CAM a la membrana plasmática, lo que a su vez promueve la invasión, la migración y la motilidad.

Las células SK-MEL-28 y SK-MEL-29 se adquirieron de la American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) y del Sloan-Kettering Memorial Center, respectivamente, y se propagaron en DMEM suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10 %. y penicilina-estreptomicina al 1%. La línea celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y que sobreexpresa α-syn (SH/αS) y las células de control SH-SY5Y fueron un amable obsequio del Dr. Joseph R Mazzulli (Northwestern University) y se propagaron en Opti-MEM suplementado con 10 % de feto bovino. suero (FBS) y penicilina-estreptomicina al 1%. La edición del genoma CRISPR/Cas9 se usó para apuntar a SNCA en células SK-MEL-29 como se describió anteriormente31 para células SK-MEL-28 usando el plásmido knockout α-syn CRISPR/Cas9 (Santa Cruz Biotechnology # sc-417273-NIC). Se usaron partículas de lentivirus que expresan α-syn humano bajo el promotor de citomegalovirus (CMV) (Applied Biological Materials, Inc, Canadá) para volver a expresar α-syn en células SK-MEL-28 KO como se describió anteriormente31. Para los experimentos de inhibición del proteasoma y la autofagia, las células se trataron con MG132 10 µM (Thermofisher Scientific, # M7449) durante 6 h y bafilomicina A1 50 nM (Millipore, # B1793) durante 5 h, respectivamente, en medio de crecimiento. Las líneas celulares se autenticaron y analizaron para detectar contaminación por micoplasma usando el kit de detección de micoplasma MycoAlert® (# LT07-318).

La preparación de lisados celulares, SDS/PAGE y análisis de transferencia Western se llevó a cabo como se describió anteriormente31. Brevemente, las células se lisaron en tampón de lisis RIPA (Tris HCl 50 mM, pH 7,4, NP-40 al 1 %, desoxicolato de sodio al 0,5 %, SDS al 0,1 %, EDTA 5 mM). Los lisados se centrifugaron (13 000 rpm/30 min/4 °C) y las concentraciones de proteínas de los sobrenadantes se determinaron con el kit de ensayo de proteínas DC™ (Bio-Rad n.º 5 000 112). Las muestras que contenían concentraciones iguales de proteína (30 μg) se trataron con ditiotreitol (Invitrogen™ NuPAGE™ Sample Reducing Agent # NP0004) y se hirvieron durante 10 min a 70 °C en NuPAGE™ LDS Sample Buffer (#NP000). Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida Bis-Tris con dodecilsulfato de sodio (SDS-PAGE) (NuPAGE™ 4 a 12 %, gel de poliacrilamida prefabricado Bis-Tris, Invitrogen n.° NP0323BOX) y luego se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno (PVDF) utilizando (Trans -Paquete de transferencia Blot® Turbo™ Mini PVDF, Bio-Rad n.º 1704156). Después de bloquear las membranas con blotto al 5 % (G-Biosciences Blot-Quikblocker n.º 786-011) en solución salina tamponada con fosfato que contenía Tween-20 al 0,1 % (v/v) (PBST) durante 1 hora a temperatura ambiente, las membranas se se cortaron en tiras y las tiras individuales se hibridaron con los anticuerpos primarios indicados durante la noche a 4 °C seguido de incubación con los respectivos conjugados de peroxidasa de rábano picante (HRP). Las bandas inmunorreactivas se visualizaron usando un sustrato de quimioluminiscencia mejorado (Clarity™ Western ECL Substrate, Bio-Rad #170-5060) y las imágenes se adquirieron usando el sistema de imágenes Biorad Chemidoc-MP. Las intensidades de banda de las proteínas de interés se cuantificaron y representaron como niveles de proteína relativos normalizados a la proteína de mantenimiento α-tubulina utilizando el software ImageJ. Los anticuerpos (con diluciones) se dan en la Tabla 2.

La invasión y el potencial metastásico de las líneas celulares de la Tabla 1 se determinaron mediante ensayos Transwell utilizando cámaras Boyden con un tamaño de poro de 8 μm (Costar; Corning, Inc. # CL3464). Brevemente, las células se suspendieron en DMEM sin suero y se sembraron en la cámara apical con (ensayo de invasión) y sin (ensayo de migración) matrigel (Corning, Inc. #356234), y se agregaron 750 μl de medio completo que contenía FBS al 10 %. a la cámara inferior del transwell durante 24 h. Después de la incubación a 37 °C durante 24 h, las células migraron/invadieron a través de la superficie inferior y se fijaron con paraformaldehído al 4 % durante 5 min y luego se tiñeron con cristal violeta al 0,1 % durante 10 min para permitir la visualización de las células. Las células de la cámara superior del transwell se extrajeron cuidadosamente con un hisopo de algodón y las imágenes de las células de la cámara inferior del transwell se tomaron con el microscopio de luz invertida Olympus.

La motilidad de las líneas celulares de melanoma de control y SNCA-KO se midió mediante el seguimiento de la capacidad de las células para eliminar el oro de su camino38. Para ello, se recubrieron placas de seis pocillos con 2 ml de BSA al 1%, se incubaron durante 3 h en un incubador de CO2 humidificado a 37 °C y se lavaron con etanol absoluto. Luego, los pocillos se recubrieron con una capa homogénea de solución de oro coloidal, preparada de la siguiente manera: un total de 3,85 ml de H2O estéril, 630 µl de 14,5 mM AuHCl4 y 2,1 ml de 36,5 mM Na2CO3, seguido de ebullición a 100 °C durante 5 min y adición de 0,1% de formaldehído. Las placas recubiertas de oro coloidal se incubaron en una incubadora con CO2 a 37 °C durante 24 h y las células se sembraron en un número final de 1 × 103 células por pocillo en un medio completo que contenía FBS al 10 %. Después de 24 h, se tomaron imágenes de los pocillos con el microscopio de luz invertida Olympus y se cuantificaron las pistas con el software ImageJ.

El ARN total se extrajo de las células utilizando el kit de ARN total basado en columnas EZNA (Omega BioTek) siguiendo las instrucciones del fabricante. La concentración y la calidad del ARN extraído se determinaron en un espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Scientific). El ADNc se sintetizó a partir del ARN purificado total (1 μg) de cada muestra mediante el kit de síntesis de ADNc iScript (Bio-Rad) de acuerdo con el protocolo del fabricante. La qPCR se realizó con los ensayos de expresión génica TaqMan™ de Applied Biosystems con conjuntos de cebador/sonda para SNCA (Hs00240906), L1CAM (Hs01109748), GAPDH (Hs02786624). Se adoptó el método ΔΔCT para calcular la cantidad relativa de cada ARNm normalizado al gen doméstico GAPDH. Los datos se analizaron mediante el método CT comparativo y el cambio de pliegue se calculó mediante el método 2−ΔΔCT con el sistema de PCR en tiempo real Bio-Rad CFX384 Touch y el software (Bio-Rad). Los resultados se expresaron como los valores relativos de log2 FC (cambio de pliegue) relativos.

Espenson51 resolvió las ecuaciones diferenciales asociadas con las reacciones en la ecuación. (2) para el caso especial [A](t = 0) = [A]o y [B]o = [C]o = 0. Las soluciones para las tres especies son

donde λ2 = ½ (p + q) y λ3 = ½(p − q) con p = k1 + k−1 + k2 y q = (p2 – 4 k1k2)1/2. Usamos las Ecs. (3), (4) y (5) para determinar los valores de [Ro](t), [Ri](t) y [Rlys](t), respectivamente.

Las simulaciones se realizaron de la siguiente manera. (i) Ecs. (3), (4) y (5) se ingresaron en un archivo EXCEL (consulte las simulaciones complementarias.xls). (ii) Se seleccionaron valores para las constantes de velocidad k1, k−1 y k2. (iii) En t = 0, todos los receptores estaban en la membrana plasmática [Ro] = 1,0 μM y [Ri] = [Rlys] = 0. (iv) Las simulaciones duraron 180 min. (v) No se produjo síntesis de proteínas durante la simulación. (vi) La base para estas simulaciones fue que α-syn, por su capacidad para unirse a las membranas, puede afectar la magnitud de cualquiera de las tres constantes de velocidad. Los valores de [Ro](t = 180 min) y [Rlys](t = 180 min) se grafican en la Fig. 6C, D. Los valores de [Rlys](t = 180 min) se grafican con signo negativo porque los receptores se degradan al entrar en el lisosoma.

Los métodos de prueba de hipótesis incluyeron un análisis de varianza (ANOVA) unidireccional con una prueba post hoc de Dunnett al comparar múltiples grupos con el control (Figs. 1 E, G, 2, 3C, D y 4C–E, G), un dos Prueba t de Student unilateral cuando se comparan dos grupos (Fig. 5 B, C, E), y prueba t de Student unilateral cuando se comparan muestras tratadas con DMSO versus baf (Fig. 3B). Todos los datos se analizaron utilizando el software GraphPad Prism (versión 6). Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar (sd) de al menos tres experimentos independientes (repeticiones biológicas). Se consideró significativo un valor de p < 0,05.

Todos los datos de este estudio están contenidos en el artículo y su información complementaria.

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Este estudio fue apoyado por fondos del Centro de Cáncer Feist-Weiller y el Canciller del Centro de Ciencias de la Salud de LSU en Shreveport a SNW

Estos autores contribuyeron por igual: Nithya Gajendran y Santhanasabapathy Rajasekaran.

Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Estatal de Luisiana, Shreveport, EE. UU.

Nithya Gajendran, Santhanasabapathy Rajasekaran y Stephan N. Witt

Centro Oncológico Feist-Weiller, Universidad Estatal de Luisiana Health Shreveport, Shreveport, EE. UU.

Stephan N. Witt

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NG y SR contribuyeron igualmente a la concepción, experimentación, análisis de datos, interpretación y revisión del estudio. SNW contribuyó a la concepción del estudio, supervisó el estudio, el análisis de datos y escribió y editó el manuscrito. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Stephan N. Witt.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Gajendran, N., Rajasekaran, S. & Witt, SN La eliminación de la alfa-sinucleína en las células de melanoma regula a la baja L1CAM y disminuye la motilidad. Informe científico 13, 9243 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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Recibido: 16 enero 2023

Aceptado: 03 junio 2023

Publicado: 07 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36451-3

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