Efectos del orden de exposición a los antimicrobianos sobre la incidencia de multidrogas

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 8826 (2023) Citar este artículo

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La Pseudomonas aeruginosa multirresistente (MDRP) es uno de los patógenos más importantes en la práctica clínica. Para aclarar los mecanismos que contribuyen a su aparición, aislamos MDRP utilizando P. aeruginosa PAO1, cuya secuencia genómica completa ya se ha dilucidado. Se aislaron cepas mutantes resistentes a carbapenémicos, aminoglucósidos y nuevas quinolonas, que se utilizan para tratar infecciones por P. aeruginosa; sin embargo, ninguno cumplió con los criterios para los MDRP. Luego, las cepas de PAO1 se expusieron a estos agentes antimicrobianos en varios órdenes y la tasa de aparición de MDRP varió según el orden de exposición; Los MDRP aparecieron con más frecuencia cuando se aplicó gentamicina antes que ciprofloxacino, pero rara vez se aislaron cuando se aplicó primero ciprofloxacino. La exposición a ciprofloxacina seguida de gentamicina aumentó la expresión de MexCD-OprJ, una bomba de salida de múltiples fármacos de tipo RND, debido a la mutación NfxB. Por el contrario, la exposición a gentamicina seguida de ciprofloxacina resultó en más mutaciones en la ADN girasa. Estos resultados sugieren que el tipo de mecanismo de resistencia a las quinolonas está relacionado con la frecuencia de MDRP y que el riesgo de incidencia de MDRP depende en gran medida del orden de exposición a la gentamicina y la ciprofloxacina.

Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista que exhibe una alta resistencia intrínseca a los agentes antimicrobianos. P. aeruginosa puede adquirir resistencia a través del uso inadecuado y/o la administración a largo plazo de agentes antimicrobianos. Se han identificado muchas cepas de P. aeruginosa resistentes a múltiples fármacos (MDRP) y son altamente resistentes a tres agentes antimicrobianos, a saber, betalactámicos de amplio espectro, aminoglucósidos y fluoroquinolonas1,2,3. Dado que la cantidad de antibióticos que son efectivos contra MDRP es limitada, las contramedidas son importantes.

Para promover el uso apropiado de agentes antimicrobianos, es importante aclarar la relación entre los agentes antimicrobianos utilizados y los mecanismos subyacentes a la adquisición de resistencia. Los análisis de aislamientos clínicos han progresado en los últimos años, lo que ha dado como resultado una comprensión más detallada de los MDRP1,2,3. Sin embargo, es imposible encontrar la cepa parental de un MDRP aislado en entornos clínicos porque una vez que se aísla el MDRP, la cepa parental susceptible ya ha desaparecido. Por lo tanto, los análisis de MDRP clínicamente aislados por sí solos no pueden revelar una relación directa entre el tipo de antimicrobiano utilizado en el tratamiento y el mecanismo subyacente a la adquisición de resistencia al mismo.

En el presente estudio, aislamos y analizamos MDRP utilizando la cepa PAO1 de P. aeruginosa, cuya secuencia de ADN genómico completo está disponible. No pudimos aislar MDRP con una exposición a uno o dos agentes antimicrobianos, pero tuvimos éxito con una exposición secuencial a tres agentes antimicrobianos. Por lo tanto, los MDRP surgieron apilando múltiples mecanismos de resistencia. También encontramos que el orden en que se usan los antimicrobianos puede afectar la aparición de MDRP.

Aislamos mutantes resistentes a los medicamentos de P. aeruginosa PAO1 para carbenicilina (betalactámicos), imipenem (carbapenems), gentamicina y amikacina (aminoglucósidos), y ciprofloxacina y levofloxacina (fluoroquinolonas), que se usan para tratar la infección por P. aeruginosa en clínica. ajustes. La frecuencia de aparición de mutantes resistentes fue de 7,5×10−7 a 1,1×10−8 (Tabla 1).

Entre 540 mutantes, se investigó el espectro de resistencia a los antibióticos en 92 mutantes seleccionados al azar. Estos mutantes se clasificaron en siete grupos según el espectro (Tabla 2). Sesenta y ocho mutantes exhibieron resistencia a múltiples fármacos (grupos 1–3). En estos grupos, el espectro de resistencia a los medicamentos fue igual o similar al patrón de sustrato de las bombas de eflujo tipo RND4,5,6,7. En algunos mutantes de cada grupo, se investigó mediante RT-PCR la expresión de genes de bomba de salida de tipo RND. La expresión de mexA se reguló positivamente en los mutantes del grupo 1 (Fig. 1A). La expresión de mexC se observó en los mutantes del grupo 2, pero no se detectó en PAO1 (Fig. 1B). La expresión de mexX aumentó en los grupos 3 y 4 (Fig. 1C). Dado que las cepas mutantes clasificadas como grupo 5 eran resistentes solo a la carbenicilina, se especula que la β-lactamasa AmpC está altamente expresada en estas cepas8. En el grupo 6, solo se observó resistencia a imipenem, y se especuló con la expresión disminuida de la porina de la membrana externa OprD9,10. Los mutantes del grupo 7 mostraron resistencia a la ciprofloxacina y la levofloxacina, lo que indica una mutación en la ADN girasa o topoisomerasa IV11. Además de los mutantes de imipenem, la mayoría de los mutantes exhibieron resistencia a múltiples fármacos, lo que sugirió la expresión regulada al alza de las bombas de salida de múltiples fármacos. Sin embargo, no se aisló ningún mutante considerado como MDRP (MIC para imipenem: 16 μg/ml o superior, amikacina: 32 μg/ml o superior, ciprofloxacina: 4 μg/ml o superior) usando este procedimiento.

Expresión de genes de bombas de eflujo multifármaco de tipo RND. (A) Panel superior: mexA, Panel inferior: rpsL (control interno), M: marcador (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CAR204, 3: CAR401, 4: LV201, 5: LV206, 6: LV438. (B) Panel superior: mexC, Panel inferior: rpsL (control interno), M: marcador (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CIP101, 3: CIP126, 4: IC4430, 5: IC4404, 6: LV235, 7: LV801. (C) Panel superior: mexX, Panel inferior: rpsL (control interno), M: marcador (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: AMK1606, 3: AMK1612, 4: GM458. (D) Panel superior: mexX, Panel inferior: rpsL (control interno), M: marcador (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: GM458, 3: IG4455, 4: CG4401, 5: CG4411, 6: CgG4479, 7: ICG444391, 8: ICG444242, 9: CIG44408. (E) Panel superior: mexX, Panel inferior: rpsL (control interno), M: marcador (pUC19/MspI), 1: PAO1, 2: CgIG44441. La línea discontinua blanca indicaba una sección cortada de una fotografía de electroforesis. Los datos sin procesar se muestran en Datos complementarios.

Dado que la frecuencia de aislamiento de un antibiótico osciló entre 10–7 y 10–8, se asociaron dificultades con el aislamiento directo de MDRP de PAO1 después de la exposición a un fármaco. Por lo tanto, asumimos que los MDRP pueden aislarse mediante exposición secuencial a tres fármacos.

Dado que los MDRP no se aislaron mediante la exposición a un solo fármaco, intentamos aislar los MDRP mediante una exposición secuencial a tres fármacos diferentes (Fig. 2). IPM429, GM458, CIP101, CIP126 y CIP131 se usaron como mutantes después de la primera exposición. El mutante IPM429 mostró un aumento de MIC para imipenem, y no se detectó la proteína de porina OprD (Tabla 3, Fig. 3). Dado que algunos mutantes resistentes a la gentamicina muestran un fenotipo de resistencia inestable, se realizaron análisis adicionales utilizando mutantes GM458 que muestran una resistencia estable a la gentamicina. GM458 mostró un aumento de MIC para gentamicina, amikacina, ciprofloxacina y levofloxacina (Tabla 3), así como la expresión regulada al alza de mexX, un componente del transportador de eflujo de múltiples fármacos de tipo RND MexXY-OprM (Fig. 1C). Se obtuvieron dos tipos de mutantes resistentes a ciprofloxacino: uno (CIP131) mostró un aumento de CMI para fluoroquinolonas (ciprofloxacino y levofloxacino) solo debido a una mutación en GyrA, una subunidad de la ADN girasa (Tabla 3, 5). El otro (CIP101 y CIP126) mostró resistencia no solo a las fluoroquinolonas, sino también a las tetraciclinas, cloranfenicol, eritromicina y acriflavina. Se informó previamente que estos fármacos se exportaban a través del transportador de eflujo de múltiples fármacos de tipo RND MexCD-OprJ4,12, y se observó la expresión regulada al alza de mexCD-oprJ (Fig. 1B). Los dos tipos de mutantes CIP se usaron como cepa parental en el siguiente paso. Los mutantes fueron expuestos a ocho secuencias de drogas diferentes.

Flujo de adquisición de mutantes. Usando PAO1 como cepa parental, inicialmente se obtuvieron mutantes resistentes de gentamicina, imipenem y ciprofloxacina. Se seleccionó una cepa representativa de entre ellas y se expuso al segundo agente antimicrobiano para obtener una cepa mutante resistente. De la misma forma, se expuso el tercer agente antimicrobiano para obtener tres mutantes resistentes a fármacos.

Análisis de transferencia Western de OprD. 1: PAO1, 2: IPM429, 3: GI4401, 4: CI4401, 5: CgI4401, 6: GCI48410, 7: CGI44201, 8: CgGI44405. Después del tratamiento de quimioluminiscencia, las transferencias se visualizaron con un sistema de formación de imágenes en gel. Aquí solo se muestran los carriles obligatorios. Los datos sin procesar antes del recorte se muestran en Datos complementarios.

Los mutantes GI se aislaron de GM458 expuesto a 4 μg/mL de imipenem. Cinco mutantes mostraron una CIM aumentada solo para imipenem (de 8 a 32 veces) (Tablas 3 y S1). En el representante GI4401, la proteína OprD no se detectó en la fracción de membrana (Fig. 3). En esta cepa, se observó una deleción de un nucleótido en la región codificante de oprD, lo que condujo a una mutación del marco de lectura (Tabla 4). Se aislaron mutantes resistentes a ciprofloxacina de GI4401 expuesto a 2 µg/ml de ciprofloxacina. La MIC para ciprofloxacina y levofloxacina aumentó en diez mutantes seleccionados al azar (4 a 16 y 8 a 16 veces, respectivamente) (Tablas 3 y S1). Los diez mutantes cumplieron los criterios de MDRP. A excepción de GIC44805, se identificaron mutaciones en la región determinante de resistencia a quinolonas (QRDR) de gyrA o gyrB. (Cuadro 5).

Aislamos mutantes resistentes a ciprofloxacina (mutantes GC) de GM458 expuestos a 2 μg/ml de ciprofloxacina. Diez de los mutantes mostraron un aumento de MIC para ciprofloxacino y levofloxacino, pero no para ningún otro fármaco (Tablas 3 y S2). Este resultado indicó que estos mutantes eran mutantes de ADN girasa, pero no mutantes regulados por aumento de MexCD-OprJ. Todos los mutantes tenían una mutación en QRDR de gyrA (Tabla 5). Se aislaron mutantes resistentes a imipenem (mutantes GCI) de GC4801 expuesto a 4 μg/mL de imipenem. Los diez mutantes de GCI exhibieron una mayor resistencia a imipenem (aumento de 16 a 32 veces como GC4801) (Tabla 3). En GCI48410, se observó una mutación de inserción en oprD, lo que resultó en una mutación de cambio de marco (Tabla 4), y la proteína OprD no se detectó en la fracción de la membrana externa (Fig. 3). Los diez mutantes GCI cumplieron los criterios para MDRP (Tabla S2).

Se aislaron mutantes resistentes a ciprofloxacina (mutantes IC) mediante la exposición de IPM429 a 1 μg/ml de ciprofloxacina. Diez mutantes IC mostraron un aumento de la MIC no solo para las fluoroquinolonas, sino también para el cloranfenicol, la eritromicina y la acriflavina (Tablas 3 y S3). La sobrerregulación de mexCD-oprJ parecía haber ocurrido. En seis de los diez mutantes, la MIC para carbenicilina, imipenem, gentamicina y amikacina disminuyó (Tabla S3). Se informó un fenómeno similar para el mutante nfxB13,14. El nivel de ARNm de mexC aumentó en IC4430, mientras que las CIM de carbenicilina, imipenem, gentamicina y amikacina no cambiaron. En IC4404, las MIC para carbenicilina, imipenem, gentamicina, amikacina se redujeron (Fig. 1B). Utilizando IC4430, se aislaron mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes ICG) mediante una exposición a 16 µg/ml de gentamicina. Los diez mutantes ICG mostraron un aumento significativo de la CIM para gentamicina y amikacina, mientras que nueve mostraron una disminución de la CIM para imipenem, ciprofloxacina, levofloxacina, tetraciclina, cloranfenicol y eritromicina (Tablas 3 y S3). En ICG444391, que mantuvo la MIC para imipenem, ciprofloxacina, levofloxacina, tetraciclina, cloranfenicol y eritromicina, mexX se expresó en gran medida en ICG444391 (Fig. 1D). Solo ICG444391 cumplió con los criterios de MDRP.

Se aislaron mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes IG) de IPM429 expuesto a 16 μg/ml de gentamicina. Diez mutantes mostraron una mayor resistencia a la gentamicina y la amikacina (8 a 16 y 4 a 8 veces, respectivamente) (Tablas 3 y S4). Estos patrones resistentes a los medicamentos indicaron la expresión regulada al alza de mexXY; sin embargo, se encontró que tres mutantes (IG4405, IG4427 e IG4485) volvían fácilmente a los niveles de expresión de la cepa parental con un subcultivo en caldo sin antibióticos. Seleccionamos IG4455 que muestra una resistencia estable para análisis posteriores. En IG4455, la expresión de mexX estaba regulada al alza (Fig. 1D). Se aislaron mutantes resistentes a ciprofloxacina (mutantes IGC) de IG4455 expuesto a 2 µg/ml de ciprofloxacina. Diez mutantes exhibieron una mayor resistencia a la ciprofloxacina y la levofloxacina (Tabla S4), y la mutación GyrB se identificó en QRDR (Ser466Phe) de todos los mutantes (Tabla 5).

La expresión regulada al alza de mexC se observó en CIP101 (Fig. 1B). Se aislaron mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes CG) tras una exposición a 16 µg/ml de gentamicina. Diez mutantes mostraron un MIC aumentado para gentamicina y amikacina (de 8 a 64 veces) (Tablas 3 y S5). En CG4401, la expresión de mexX estaba regulada al alza (Fig. 1D). Se aislaron mutantes resistentes a imipenem (mutantes CGI) de CG4401 con 2 μg/ml de imipenem, y diez mutantes mostraron un aumento de la MIC solo para imipenem (de 8 a 16 veces) (Tablas 3 y S5). La proteína OprD no se detectó en la fracción de membrana de CGI44201 (Fig. 3). Se identificó una gran deleción en la región de codificación oprD (Tabla 4). Los diez mutantes CGI se definieron como no MDRP porque la MIC para imipenem fue inferior a 16 μg/ml.

Intentamos aislar mutantes resistentes a imipenem (mutantes CI) de CIP101 expuestos a 2 μg/ml de imipenem, pero no tuvimos éxito por razones desconocidas. Sin embargo, los mutantes de CI se aislaron de CIP126, un mutante con la expresión regulada al alza de mexC, expuesto a 4 μg/ml de imipenem. Los diez mutantes CI mostraron una CIM 16 veces mayor para imipenem (Tablas 3 y S6). La proteína OprD no se detectó en la fracción de membrana de CI4401 (Fig. 3) y se identificó una mutación sin sentido en la región codificante de oprD (Tabla 4). Los mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes CIG) de CI4401 aislados con 16 μg/ml de gentamicina mostraron una mayor resistencia a la gentamicina y la amikacina (Tablas 3 y S6). Uno de estos mutantes, CIG44408, mostró la expresión regulada al alza de mexX (Fig. 1E). Tres de los diez mutantes CIG (CIG44402, CIG44404 y CIG44408) se clasificaron como MDRP.

CIP131 exhibió una mayor resistencia a la ciprofloxacina y la levofloxacina, lo que indicó que era un mutante de ADN girasa. Identificamos una mutación puntual (Thr83Ile) en el QRDR de GyrA (Tabla 5). Utilizando 16 μg/ml de gentamicina, aislamos mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes CgG). Nueve mutantes CgG mostraron una MIC más alta que CIP131 para gentamicina, amikacina, ciprofloxacina y levofloxacina (Tablas 3 y S7). La expresión regulada al alza de mexX se observó en CgG4479 (Fig. 1D). Se aislaron mutantes resistentes a imipenem (mutantes CgGI) de CgG4479 expuesto a 4 µg/ml de imipenem. Los diez mutantes CgGI mostraron una CIM de 8 a 16 veces más alta solo para imipenem (Tablas 3 y S7). Cinco de los diez mutantes fueron reconocidos como MDRP. En CgGI44405 se identificó una deleción de un nucleótido en oprD, que resultó en una mutación del marco de lectura (Tabla 4), mientras que la proteína OprD no se detectó en la fracción de la membrana externa (Fig. 3).

Se aislaron mutantes resistentes a imipenem (mutantes CgI) de CIP131 con 4 µg/ml de imipenem. Los diez mutantes de CgI mostraron una mayor resistencia solo a imipenem (Tablas 3 y S8), y se identificó una deleción de un nucleótido (y una mutación de cambio de marco) en oprD en CgI4401 (Tabla 4). La proteína OprD no se detectó mediante un análisis de inmunotransferencia (Fig. 3). Los mutantes resistentes a la gentamicina (mutantes CgIG) se aislaron con 16 µg/ml de gentamicina. Estos mutantes mostraron una CIM aumentada para gentamicina, amikacina, ciprofloxacina y levofloxacina (Tablas 3 y S8). Se observó una mayor expresión de mexX en CgIG44441 (Fig. 1D). Ocho mutantes se clasificaron como MDRP.

Se consideró la tasa de aparición de MDRP según MIC para ciprofloxacina, gentamicina e imipenem. En el caso de los mutantes GCI, GIC e IGC, todos los mutantes se clasificaron como MDRP. Cinco de diez mutantes CgGI mostraron una CIM de 8 μg/ml para imipenem, mientras que los cinco restantes mostraron 16 μg/ml. Dado que esta diferencia era solo doble, se consideró insignificante. El orden secuencial de GCI, GIC, IGC y CgGI aumentó la tasa de aparición de MDRP.

Los MDRP no se incluyeron en los mutantes CGI. Entre los mutantes ICG, CIG y CgIG, algunas cepas eran MDRP. Sin embargo, muchos MDRP exhibieron una resistencia inestable a la gentamicina. Uno y tres MDRP se incluyeron inicialmente en mutantes ICG y CIG, respectivamente; sin embargo, la resistencia a la gentamicina desapareció después del subcultivo. En CgIG, aunque inicialmente ocho aislamientos mostraron el fenotipo MDRP, siete fueron MDRP inestables.

Aquí intentamos aclarar los mecanismos que contribuyen a la aparición de MDRP. Como era de esperar, no pudimos aislar los MDRP después de una exposición a un solo fármaco. Tampoco aislamos ningún MDRP después de una exposición simultánea a tres fármacos, hasta el momento. Si la frecuencia de aparición de mutantes para cada fármaco es 10-8, la frecuencia de triple resistencia será 10-24. Esta probabilidad no es cero, pero es casi imposible de lograr en un laboratorio o entorno clínico. Por otra parte, los MDRP se obtuvieron tras una exposición secuencial a cada fármaco. Según lo informado por muchos médicos y farmacéuticos, el uso secuencial de diferentes tipos de medicamentos promovió la aparición de MDRP con un mayor riesgo.

El orden de exposición al fármaco afectó la aparición de los MDRP. Una exposición a la gentamicina antes de la ciprofloxacina resultó en una mayor tasa de aparición de MDRP. Este resultado indicó que los mecanismos subyacentes a la resistencia a la ciprofloxacina están relacionados con la tasa de aparición de MDRP. Después de la exposición inicial a la ciprofloxacina, aumentaron las CIM de cloranfenicol, eritromicina y acriflavina, así como de ciprofloxacina y levofloxacina. Tales patrones de resistencia fueron consistentes con los sustratos de transporte para MexCD-OprJ. Como lo reveló RT-PCR (Fig. 1B), la expresión de mexC aumentó significativamente en CIP126. Se observó un fenómeno similar para los mutantes IC de IPM429. Estos resultados indicaron aumentos en la expresión de mexC en células expuestas a ciprofloxacino antes de la expresión regulada al alza de mexXY. Por otro lado, la expresión de mexXY ya estaba regulada positivamente en células tratadas con ciprofloxacina expuestas a gentamicina, y se detectó una mutación en la ADN girasa en todos los mutantes (mutantes GC, IGC y GIC). Por lo tanto, el orden de exposición a los agentes antimicrobianos puede afectar el mecanismo de resistencia, es decir, una mutación de la girasa o la mayor expresión de mexCD-oprJ, con MDRP estables que emergen con órdenes específicos.

Varios mecanismos de resistencia a los aminoglucósidos en P. aeruginosa se han informado hasta la fecha, como la inactivación con enzimas modificadoras, mutaciones en los ribosomas y la hiperexpresión de mexXY15. Muchos mutantes mostraron hiperexpresión de mexXY en el presente estudio. Además, se han reportado mutaciones relacionadas con la hiperexpresión de mexXY7,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26. Aunque aún no hemos identificado cambios de nucleótidos para la resistencia a la gentamicina en nuestros mutantes, pueden proporcionar información importante sobre la frecuencia de los MDRP.

También se aislaron mutantes inestables resistentes a la gentamicina con cierta frecuencia en cada paso en el aislamiento de mutantes de gentamicina. Esto puede ser un tipo de 'resistencia adaptativa'27. En nuestros experimentos, se seleccionaron mutantes estables de gentamicina para el segundo o tercer paso. Se aislaron muy pocos mutantes estables de gentamicina en el tercer paso; por lo tanto, la estabilidad de la resistencia a la gentamicina también puede ser un factor clave que contribuya a la incidencia de los MDRP.

La adquisición de genes exógenos puede ser importante como mecanismo para la aparición de MDRP en sitios clínicos. Es necesario considerar la modificación de la enzima para la resistencia a la gentamicina y la metalo β-lactamasa para la resistencia al imipenem. Dado que la adquisición de genes exógenos no puede ocurrir en el laboratorio, es posible que los presentes resultados no reflejen directamente los mecanismos subyacentes a la aparición de MDRP en entornos clínicos. Sin embargo, los resultados obtenidos indicaron que los factores de riesgo para la aparición de MDRP son (1) una resistencia estable a la gentamicina y (2) una exposición a la gentamicina antes que a la ciprofloxacina. Si se prescribe ciprofloxacina para tratar infecciones con cepas que desarrollaron resistencia estable a la gentamicina mediante la incorporación de genes exógenos de resistencia a la gentamicina, la frecuencia de MDRP puede aumentar notablemente. Revelar la prevalencia de genes exógenos de resistencia a la gentamicina en entornos clínicos puede proporcionar una imagen completa de la aparición de MDRP.

Mostramos que la tasa de aparición de MDRP varió según el orden de exposición; Los MDRP aparecieron con más frecuencia cuando se aplicó gentamicina antes que ciprofloxacino, pero rara vez se aislaron cuando se aplicó primero ciprofloxacino. Y la exposición a ciprofloxacina seguida de gentamicina aumentó la expresión de MexCD-OprJ, una bomba de salida de múltiples fármacos de tipo RND, debido a la mutación NfxB. Por el contrario, la exposición a gentamicina seguida de ciprofloxacina resultó en más mutaciones en la ADN girasa. Estos resultados sugieren que el tipo de mecanismo de resistencia a las quinolonas está relacionado con la frecuencia de MDRP y que el riesgo de incidencia de MDRP depende en gran medida del orden de exposición a la gentamicina y la ciprofloxacina.

Se cultivaron células de P. aeruginosa PAO1 o mutantes (107 a 109 CFU) en medio L (polipeptona al 1,0 %, extracto de levadura al 0,5 % y NaCl al 0,5 %, pH 7,0) y se esparcieron en placas de agar L (polipeptona al 1,0 %, polipeptona al 0,5 % extracto de levadura, NaCl al 0,5 % y agar al 1,5 %, pH 7,0) que contiene 1 × , 2 × , 4 × MIC para uno de los siete agentes antimicrobianos siguientes: carbenicilina, imipenem, amikacina, gentamicina, ciprofloxacina, levofloxacina y eritromicina. Obtuvimos muchas colonias que aparecieron en las placas después de una incubación a 37 ℃ durante 24-36 h. Después del aislamiento de una sola colonia, se investigaron los patrones de resistencia a fármacos de los mutantes. Amikacina (Wako, cat. 014-24941), carbenicilina (Wako, cat. 037-23693), ciprofloxacina (Wako, cat. 032-18731), gentamicina (Wako, cat. 079-02973), imipenem (Wako, cat. 098-07283), la levofloxacina (Fluka, cat. 28266) se adquirieron de los fabricantes indicados.

Las concentraciones inhibitorias mínimas (MIC) para varios fármacos se evaluaron en caldo Muller-Hinton (Difco) mediante el método de dilución doble de acuerdo con las recomendaciones del CLSI (CLSI, 2006). Las células del medio de prueba (105 células ml-1) se incubaron a 37 °C durante 24 horas y luego se midió el crecimiento.

Las preparaciones de ARN y la PCR transcripcional inversa se realizaron de acuerdo con los protocolos del fabricante. Brevemente, se aisló el ARN bacteriano total a partir de células cultivadas hasta una DO650 de 0,7 utilizando el kit RNeasy Mini (Qiagen). El ADN residual se eliminó mediante el tratamiento con ADNasa libre de ARNasa (Promega). Se usó un nanogramo de ARN tratado con DNasa como molde para una reacción usando el kit Qiagen OneStep RT-PCR (Qiagen). Los pares de cebadores para detectar ARNm se enumeran en la Tabla S9. La expresión del gen rpsL se utilizó como control interno. Los ciclos de PCR fueron 27 para mexA, 33 para mexC, 32 para mexX y 24 para rpsL. Los productos se separaron usando electroforesis en gel de agarosa al 3% (Nippongene) y se visualizaron con bromuro de etidio.

La preparación de OprD se realizó mediante el método descrito anteriormente con una ligera modificación28. Las células de P. aeruginosa se cultivaron hasta la fase logarítmica media (OD650 = 0,7), se recolectaron y se suspendieron en Tris-HCl 50 mM (pH 7,4) + MgSO4 5 mM. Las células se rompieron con el sonicador Vibra cell VC505. Se eliminaron las células intactas, la fracción de membrana se preparó con ultracentrifugación (100.000 × g). El sedimento se lavó dos veces y se disolvió con el mismo tampón. La electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida se realizó como se describió previamente29, 40 μg por muestra. Las proteínas se transfirieron a un filtro de membrana de nitrocelulosa (ADVANTEC Toyo). Meiji Seika Pharma Co.30 proporcionó amablemente un anticuerpo anti-OprD de conejo. Se usó un anticuerpo IgG anti-conejo de cabra (Bioss Inc, cat. bs-0295G-HRP) como segundo anticuerpo y se detectó OprD usando el sistema ECL (Amersham Pharmacia Biotech).

Los conjuntos de datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Nos gustaría agradecer a Meiji Seika Pharma Co., Ltd. por proporcionar amablemente el anticuerpo Anti-OprD de conejo. Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI Grant Número JP16390131.

Estos autores contribuyeron por igual: Nami Yasuda y Tomoko Fujita.

Departamento de Microbiología, Facultad de Medicina, Odontología y Ciencias Farmacéuticas, Universidad de Okayama, 1-1-1, Tsushima-Naka, Kita-ku, Okayama, 700-8530, Japón

Nami Yasuda, Tomoko Fujita, Takahiro Fujioka, Mei Tagawa, Naoki Kohira, Daichi Morita, Wakano Ogawa, Tomofusa Tsuchiya y Teruo Kuroda

Departamento de Microbiología, Escuela de Graduados en Ciencias Biomédicas y de la Salud, Universidad de Hiroshima, 1-2-3, Kasumi, Minami-ku, Hiroshima, 734-8553, Japón

Kensho Torimaru, Takanori Kumagai, Daichi Morita y Teruo Kuroda

Departamento de Biología Molecular, Facultad de Farmacia, Universidad de Shujitsu, 1-6-1 Nishigawara, Naka-ku, Okayama, 703-8516, Japón

Sumiko Shiota

Departamento de Microbiología y Bioquímica, Universidad de Farmacia de Daiichi, 22-1, Tamagawa-Machi, Minami-ku, Fukuoka, 815-8511, Japón

wakano ogawa

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WO, TT y TK planificaron este proyecto. DM y TK escribieron el manuscrito principal. NY, TF, TF y NK aislaron mutantes y realizaron la prueba de susceptibilidad a fármacos y RT-PCR. NY y DM realizaron el análisis de transferencia Western. TF, MT y KT identificaron sitios de mutación. NY, TF, TF y TK prepararon figuras y tablas. WO, SS, TK y DM tuvieron discusiones críticas con TK Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Teruo Kuroda.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Yasuda, N., Fujita, T., Fujioka, T. et al. Efectos del orden de exposición a los antimicrobianos sobre la incidencia de Pseudomonas aeruginosa multirresistente. Informe científico 13, 8826 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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Recibido: 24 junio 2022

Aceptado: 15 de mayo de 2023

Publicado: 31 mayo 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-35256-8

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