Las amplificaciones del gen de la bomba de eflujo eluden la necesidad de múltiples mutaciones objetivo para la resistencia contra la doble

Nature Communications volumen 14, Número de artículo: 3402 (2023) Citar este artículo

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Los antibióticos que tienen objetivos celulares múltiples teóricamente reducen la frecuencia de la evolución de la resistencia, pero las trayectorias adaptativas y los mecanismos de resistencia contra tales antibióticos están poco estudiados. Aquí investigamos estos en Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) utilizando la evolución experimental tras la exposición a delafloxacina (DLX), una nueva fluoroquinolona que se dirige tanto a la ADN girasa como a la topoisomerasa IV. Mostramos que la selección de mutaciones de secuencia codificante y amplificaciones genómicas del gen que codifica una bomba de expulsión mal caracterizada, SdrM, conduce a una alta resistencia a DLX, eludiendo el requisito de mutaciones en ambas enzimas objetivo. En las poblaciones evolucionadas, la sobreexpresión de sdrM debida a amplificaciones genómicas que contienen sdrM y dos genes adyacentes que codifican bombas de salida da como resultado una alta resistencia a DLX, mientras que las bombas de salida adyacentes que hacen autostop contribuyen a la resistencia cruzada de la estreptomicina. Además, la falta de sdrM requiere mutaciones en ambas enzimas objetivo para desarrollar resistencia a DLX y, por lo tanto, sdrM aumenta la frecuencia de desarrollo de resistencia. Finalmente, las mutaciones y amplificaciones de sdrM se seleccionan de manera similar en dos aislados clínicos diversos, lo que indica la generalidad de este mecanismo de resistencia a DLX. Nuestro estudio destaca que, en lugar de tasas reducidas de resistencia, la evolución de la resistencia a los antibióticos de objetivos múltiples puede implicar caminos evolutivos alternativos de alta frecuencia, que pueden causar alteraciones inesperadas del panorama de la aptitud, incluida la resistencia cruzada a los antibióticos.

La aparición de resistencia a los antimicrobianos (RAM) es una gran amenaza para la salud mundial. Un informe reciente indicó que puede haber habido más de un millón de muertes en todo el mundo debido a AMR en 20191. El Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) causa una amplia gama de infecciones asociadas con la atención médica y la comunidad, con altas tasas de incidencia y mortalidad. y puede lograr resistencia contra la mayoría de los antibióticos disponibles2,3,4,5,6,7. Los determinantes de resistencia en las bacterias generalmente se adquieren a través de la transferencia horizontal de genes o mutaciones de novo, y los mecanismos incluyen la degradación o el secuestro de antibióticos, la modificación de los componentes objetivo y la sobreproducción de bombas de expulsión8,9,10,11. Además, las duplicaciones y amplificaciones genómicas ubicuas e inestables pueden conducir a una mayor expresión de enzimas modificadoras y bombas de expulsión que luego confieren resistencia a los antibióticos y pueden ser seleccionadas tras la exposición a los antibióticos12,13,14.

Una estrategia que se ha propuesto para reducir el aumento de la resistencia a los antibióticos es desarrollar antibióticos con más de un objetivo, reduciendo así la frecuencia de evolución de la resistencia15,16. Estudios recientes han identificado dos de estos antibióticos de acción dual que se dirigen a la integridad de la membrana, así como a una vía celular adicional, y hasta ahora han evitado la aparición de resistencia en el laboratorio17,18,19. Las topoisomerasas bacterianas, la ADN girasa y la topoisomerasa IV también se han propuesto como objetivos potenciales para los antibióticos de acción dual, y se ha demostrado que dirigirse a ambas enzimas puede inhibir la evolución de la resistencia y potencialmente implicar nuevos determinantes de resistencia15,16,20,21 . Sin embargo, no se han caracterizado los mecanismos de evolución de la resistencia a tales antibióticos de objetivos múltiples y las trayectorias adaptativas subyacentes.

Las fluoroquinolonas son una clase de antibióticos ampliamente utilizada, y la mayoría de las fluoroquinolonas tradicionales, como la ciprofloxacina y la levofloxacina, se dirigen preferentemente a la ADN girasa o a la topoisomerasa IV22. La delafloxacina (DLX) es un antibiótico de fluoroquinolona de cuarta generación, que se dirige tanto a la ADN girasa como a las enzimas topoisomerasa IV con una potencia similar23,24,25. Debido a esta orientación dual, se pensó que la resistencia contra DLX podría ser poco frecuente24,26,27, pero recientemente se observó resistencia a DLX en aislamientos clínicos de S. aureus28,29.

En este estudio, investigamos la evolución de la resistencia de MRSA a los antibióticos de acción dual, utilizando la evolución experimental de múltiples poblaciones independientes de MRSA en concentraciones crecientes de DLX. Observamos que, además de las mutaciones en las enzimas ADN girasa y topoisomerasa IV, las mutaciones de la secuencia de codificación en la bomba de salida de la superfamilia de facilitadores principales SdrM (resistencia a los medicamentos de Staphylococcus) y las amplificaciones genómicas de sdrM y las bombas de salida vecinas sepA y lmrS están muy extendidas en el poblaciones evolucionadas, y típicamente evolucionan antes que las mutaciones canónicas. Las mutaciones de la secuencia de codificación de sdrM confieren resistencia moderada a DLX y aumentan la capacidad de evolución de dicha resistencia, mientras que las amplificaciones genómicas conducen a una alta resistencia a DLX. La variación del número de copias de la región amplificada depende de la presión selectiva y provoca la heterogeneidad de la población para la resistencia a DLX. Encontramos que si bien la actividad sdrM proporciona la ventaja de aptitud para la selección de estas amplificaciones genómicas tras la exposición a DLX, el hacer autostop de las bombas de eflujo vecinas en la amplificación genómica conduce a una resistencia cruzada contra el aminoglucósido estreptomicina. Además, mostramos que en ausencia de actividad sdrM, la resistencia a DLX requiere mutaciones tanto en la enzima ADN girasa como en la topoisomerasa IV y, por lo tanto, surge con una frecuencia más baja. Finalmente, demostramos que las amplificaciones y mutaciones genómicas de sdrM también son comunes en poblaciones de un MRSA y un aislado clínico de S. aureus sensible a la meticilina (MSSA), cada uno tras la selección para la resistencia a DLX.

Evolucionamos diez poblaciones independientes de la cepa JE2 de MRSA en concentraciones crecientes de DLX durante 7 a 10 pases diarios. DLX inhibe las enzimas ADN girasa y topoisomerasa IV con una potencia similar, lo que aumenta la posibilidad de que la resistencia a DLX se desarrolle con poca frecuencia27. Sin embargo, las diez poblaciones pudieron crecer en concentraciones de DLX que eran de 64 a 1024 veces la concentración inhibitoria mínima (MIC) de la cepa JE2 parental (Conjunto de datos complementarios 1, consulte Materiales y métodos para la nomenclatura de cepas). La cepa JE2 tuvo una MIC de 0,133 ± 0,027 μg/ml en medio MH2, que está por debajo del punto de corte clínico de 0,25 μg/ml23,24,25. Se analizó la resistencia a DLX de tres aislamientos individuales del pase terminal de cada población evolucionada y todos los aislamientos mostraron CIM de DLX que oscilaban entre ~2 y 33 μg/ml (Fig. 1a complementaria), lo que confirma la evolución de una alta resistencia a DLX. Llevamos a cabo la secuenciación del genoma completo en estos aislamientos, así como en aislamientos y poblaciones adicionales de pasajes anteriores de la evolución (Conjunto de datos complementarios 2). Como era de esperar, varios aislamientos y poblaciones resistentes tenían mutaciones en los genes que codifican las subunidades de la ADN girasa (gyrA o gyrB) o la topoisomerasa IV (parC o parE) o ambas (Fig. 1). La mayoría de los polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) que surgieron en estos objetivos canónicos, como S85P y E88K en gyrA, R458L en gyrB, E84K y A116V en parC, y D432G y P585S en parE, se encuentran en la región determinante de la resistencia a las quinolonas (QRDR) de estas proteínas y se han asociado previamente con la resistencia a las fluoroquinolonas26,30,31,32,33. También identificamos otras mutaciones como W592R en gyrB, S520R en parC y S437P en parE en nuestros mutantes, que pueden ser nuevos alelos de resistencia a DLX.

Se muestra para poblaciones de pasajes intermedios, así como los tres aislamientos del pasaje terminal, para las diez poblaciones evolucionadas independientemente. Para cada población independiente, los pasajes anteriores a los posteriores se muestran de izquierda a derecha. Los cuadrados azules o amarillos muestran la presencia de la mutación (SNP o amplificación) en una población o en un aislado terminal, respectivamente. Las concentraciones terminales de DLX representan las concentraciones finales del experimento de evolución (momento en el que se obtuvieron los aislamientos).

A pesar de las numerosas mutaciones objetivo canónicas, varios aislamientos resistentes, así como poblaciones de pasajes intermedios de la mayoría de las diez poblaciones independientes, no portaban ninguna mutación canónica en los genes que codifican las enzimas ADN girasa o topoisomerasa IV o tenían mutaciones en solo uno de los genes. objetivos (Fig. 1 y Conjunto de datos complementario 2). Estos incluyen todas las muestras de las poblaciones 1, 3 y 6, así como las poblaciones de múltiples pases tempranos de las poblaciones 2, 4, 5, 7, 8 y 9. GyrA* evolucionado (gyrAE88K) o parE* (parED432G) los alelos mutantes condujeron individualmente a un aumento leve en las CIM de DLX de hasta 0,4 μg/ml (Fig. 1b complementaria), lo que sugiere que es probable que otros genes desempeñen un papel en la resistencia a DLX en varias de nuestras poblaciones evolucionadas.

Un examen más detenido de los resultados de la secuenciación de nuestro genoma completo reveló que las mutaciones en la bomba de expulsión SdrM (resistencia a los medicamentos de Staphylococcus) eran comunes en las poblaciones evolucionadas (Fig. 1). SdrM es una bomba de eflujo de la superfamilia de facilitadores principales (MFS)34. Se ha demostrado que la sobreexpresión de SdrM confiere un aumento del doble en las CMI de norfloxacina y bromuro de etidio; sin embargo, esta bomba de expulsión no se ha implicado en la evolución de la resistencia a los antibióticos34. Contrariamente a las mutaciones típicas de la bomba de expulsión que ocurren en la región promotora (o en un represor), observamos que ocho de las diez poblaciones evolucionadas contenían una de las dos mutaciones de la secuencia codificante de sdrM, Y363H (sdrM1*) o A268S (sdrM2*), pero ninguno de los aislados evolucionados tenía ambos (Fig. 1, Conjunto de datos complementario 2), lo que plantea la posibilidad de que estas dos mutaciones puedan tener una funcionalidad similar. La población 6 tenía una mutación aguas arriba de la secuencia de codificación de sdrM (en la posición -164) que puede afectar la regulación de la expresión de sdrM, además de la mutación A268S (sdrM3*).

La alineación de la secuencia de aminoácidos de SdrM con otras bombas de salida de MFS conocidas utilizando la base de datos de dominios conservados35 mostró que los residuos A268 e Y363 probablemente estén situados en el bolsillo de unión de la bomba de salida de SdrM (Fig. 2 complementaria), lo que sugiere que las mutaciones afectan la unión de SdrM a DLX. La visualización de la estructura proteica predicha de SdrM usando AlphaFold36,37 indicó que A268 e Y363 están muy cerca uno del otro (Fig. 3 complementaria).

Además de los alelos sdrM, el análisis de cobertura de los resultados de la secuenciación del genoma completo reveló que la cobertura del gen sdrM era de 2 a 5 veces mayor que la cobertura media del genoma en múltiples mutantes evolucionados, en comparación con la cobertura de ~1x en el WT, lo que indica una amplificación del gen sdrM en las diez poblaciones evolucionadas (Fig. 1, Conjunto de datos complementarios 2).

Construimos mutantes de reemplazo de alelos sdrM individuales en la cepa JE2 de tipo salvaje (WT) y determinamos el efecto de los alelos evolucionados en la resistencia y el flujo de salida de DLX. Los mutantes construidos con los alelos sdrM1* o sdrM2* mostraron un aumento de ~2 veces en la resistencia a DLX, mientras que los que portaban el alelo sdrM3* (que consiste en una mutación de secuenciación intergénica y codificante) mostraron un aumento de ~4 veces (Fig. 2a). Medimos la fluorescencia intrínseca de DLX38 para determinar indirectamente la concentración intracelular de DLX (Fig. 4a complementaria). Calculamos la tasa de salida en los tres mutantes de reemplazo alélicos, así como el WT y un mutante con una inserción de transposón en sdrM (sdrM :: Tn) como controles (Fig. 2b). Como se esperaba, las cepas WT y sdrM::Tn tenían las concentraciones intracelulares de DLX más altas, mientras que los tres mutantes de reemplazo de alelos tenían niveles más bajos, lo que sugiere que los alelos sdrM evolucionados condujeron a un mayor flujo de salida. Usando un modelo matemático simplificado, determinamos que las tasas de salida de DLX de sdrM1*, sdrM2* y sdrM3* eran ~2–9 veces más altas que sdrM::Tn, mientras que la tasa de WT era similar a sdrM::Tn. (Fig. 4b complementaria).

a DLX MICs de WT, y los tres mutantes de sustitución alélica sdrM en M63. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de cinco réplicas biológicas. Se muestra la significación para la comparación con el WT, o entre mutantes como se indica, según lo probado por ANOVA unidireccional con la prueba de Tukey para comparaciones múltiples (*P < 0,05, P para WT frente a sdrM1 = 0,0138, WT frente a sdrM2 = 0,0486, * *P < 0,01, sdrM1* frente a sdrM3* P = 0,0015, ***P < 0,001, sdrM2* frente a sdrM3* P = 0,0004, ****P < 0,0001). b Se midió la fluorescencia normalizada (fluorescencia intrínseca de DLX/OD600) para las cepas indicadas, como representante de la concentración de DLX intracelular. Los datos que se muestran son la media ± error estándar de tres réplicas biológicas. c Porcentaje de las 12 poblaciones independientes de las cepas indicadas que desarrollaron resistencia a DLX a lo largo del tiempo cuando evolucionaron en 2,5 veces las CIM de DLX respectivas. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

A partir de nuestros resultados de secuenciación del genoma completo, observamos que en ocho de las diez poblaciones evolucionadas, las mutaciones sdrM (ya sea un SNP o la amplificación) surgieron en un pasaje anterior en comparación con las mutaciones canónicas de ADN girasa o topoisomerasa IV (Fig. 1). Esto sugiere una cascada evolutiva en la que las mutaciones de la bomba de expulsión facilitan la selección de mutaciones canónicas para la resistencia a DLX. Para probar si las mutaciones de sdrM pueden afectar la capacidad de evolución de la resistencia en presencia de DLX, desarrollamos 12 poblaciones independientes, cada una de WT, y mutantes que portaban los alelos evolucionados de sdrM individuales con pases diarios en concentraciones fijas de delafloxacina, que eran 2,5 veces las CIM respectivas . Si bien solo una población WT desarrolló resistencia, 3 o 4 poblaciones de sdrM1*, sdrM2* y sdrM3* desarrollaron resistencia durante el experimento (Fig. 2c).

Examinamos la diversidad alélica de la proteína SdrM para determinar si los alelos evolucionados que identificamos (A268S e Y363H), o cualquier otra mutación en el bolsillo de unión de SdrM, se ven en genomas disponibles públicamente de aislados de S. aureus. Se consultó la secuencia de la proteína JE2 SdrM frente a un conjunto de 63 980 genomas de S. aureus de la base de datos de detección de patógenos del NCBI. Si bien no se observaron mutaciones en la posición Y363, identificamos una cepa con una mutación A268S y otras siete cepas con una mutación A268V (Conjunto de datos complementario 3). Además, estas cepas de S. aureus albergaban numerosas mutaciones en otros residuos del bolsillo de unión de SdrM previsto.

Además de las mutaciones puntuales en sdrM, identificamos 13 tipos distintos de amplificaciones de nuestros datos de secuenciación del genoma completo en nuestras diez poblaciones evolucionadas, que amplificaron el gen sdrM (Figs. 1 y 3a, Conjunto de datos suplementario 4, Fig. 5 suplementario) . Se confirmó al menos un caso de cada tipo de amplificación mediante PCR y secuenciación de Sanger de las nuevas uniones. Un extremo de cada amplificación estaba dentro de un grupo de genes rRNA-tRNA ubicado aguas abajo de sdrM (terminal 1), mientras que el otro extremo estaba dentro o entre los cinco genes aguas arriba de sdrM (terminal 2) (Fig. 3a). Si bien cinco de estas amplificaciones tenían una microhomología de 4 a 12 pares de bases entre los dos terminales, las otras tenían una homología de un solo par de bases o ninguna homología (Conjunto de datos complementario 4). Varias de las amplificaciones se encontraron en múltiples poblaciones y, en algunas poblaciones, se observaron diferentes amplificaciones en diferentes pasajes, lo que indica que las amplificaciones son dinámicas (Fig. 6 complementaria). El gen sdrM está presente aguas arriba de dos bombas de eflujo adicionales sepA e lmrS39,40, y ambos genes estaban presentes en las amplificaciones en todos los casos (Fig. 3a). El análisis de vecindad de genes utilizando la base de datos STRING41 indicó que las tres bombas de salida (junto con una proteína de la familia de la hemolisina III) se encuentran una al lado de la otra en el genoma en casi todas las especies de Staphylococcus (Figura 7 complementaria).

a El locus genómico sdrM y los 13 tipos distintos de amplificaciones del gen de la bomba de expulsión observados en las poblaciones evolucionadas. Se muestran las regiones que contienen los dos extremos de la amplificación en todos los casos (Terminales 1 y 2). b Cobertura de lectura relativa de las regiones amplificadas en comparación con el genoma completo para las cepas indicadas. Las líneas representan un ajuste suavizado usando un modelo aditivo generalizado considerando los 100 vecinos más cercanos. c Doble cambio del número de copias de sdrM, lmrS y sepA en los aislamientos indicados en comparación con el WT medido por qPCR de ADN genómico. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres repeticiones técnicas. d Cambio de veces en la expresión de sdrM, lmrS y sepA en los aislamientos indicados en comparación con WT, medido por RT-qPCR. Los datos que se muestran son la media de dos réplicas biológicas. e DLX MIC de los aislamientos indicados en M63. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. f Fluorescencia normalizada (fluorescencia intrínseca de DLX/OD600) de las cepas indicadas, como proxy de la concentración de DLX intracelular. Los datos que se muestran son la media ± error estándar de tres réplicas biológicas. Se muestra la significación para la comparación con el valor de c WT establecido en 1 según lo probado por una prueba de Kruskal-Wallis seguida de una prueba de Dunn no corregida para cada comparación y e WT según lo probado por las pruebas ANOVA unidireccional de Brown-Forsythe y Welch, seguido de una prueba de Dunn no corregida para cada comparación. Prueba t de dos colas con corrección de Welch para cada comparación (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). c 1.7a: P para sdrM = 0.0025, lmrS = 0.0079, sepA = 0.0025, 4.2a: P para sdrM = 0.0279, lmrS = 0.0438; y e, P para 1.7a = 0.0295, 4.2a = 0.0238, 6c = 0.006. Los datos de origen para b–f se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Para caracterizar aún más los efectos de las amplificaciones genómicas, analizamos tres aislados evolucionados que contenían solo mutaciones no canónicas: 1.7a, 4.2ay 6c. Se predijo que los tres aislamientos tendrían amplificaciones de la bomba de salida, donde 1.7a tenía amplificación tipo 9 y tanto 4.2a como 6c tenían amplificación tipo 1 (Fig. 3b, Conjunto de datos complementario 4). Mientras que 4.2a tenía el alelo sdrM WT, 1.7a tenía el alelo sdrM2* y 6c tenía ~40 % de lecturas asignadas al alelo sdrM3* en los datos de secuenciación del genoma completo, lo que sugiere que la amplificación contenía los alelos WT y sdrM3*. Además, 1.7a y 6c tenían mutaciones en algunos otros genes no canónicos, pero estas mutaciones no afectaron la resistencia a DLX (Conjunto de datos complementario 2, Figura complementaria 8).

Los genes sdrM, lmrS y sepA mostraron un aumento de 3 a 10 veces en el número de copias en 1.7a, 4.2a y 6c, mientras que un aislado de control evolucionado, 3a, que se predijo que no tendría la amplificación, mostró una copia similar número al WT, medido por qPCR de ADN genómico y datos de cobertura de la secuenciación del genoma completo (Fig. 3b, c, Fig. 9 complementaria). Además, 1.7a, 4.2a y 6c mostraron un aumento de 5 a 500 veces en la expresión génica de las tres bombas de eflujo en comparación con la cepa WT, según lo medido por PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) (Fig. 3d). La expresión dramáticamente más alta en comparación con el número de copias, especialmente en 1.7a y 4.2a, probablemente refleja una regulación alterada de las bombas de salida en las amplificaciones. Los tres aislamientos tenían una resistencia a DLX de ~5 a 100 veces mayor y un alto flujo de salida de DLX en comparación con la cepa WT parental (Fig. 3e, f).

Para probar si la sobreexpresión de las bombas de eflujo amplificadas individualmente o en combinación puede aumentar la resistencia a DLX, sobreexpresamos sepA, lmrS o los alelos sdrM parentales o evolucionados bajo el control de los promotores nativos correspondientes usando el plásmido pKK3042. En estas cepas, la expresión de las bombas de eflujo aumentó entre ~ 10 y 100 veces en comparación con un control de vector vacío (Fig. 10a complementaria). La sobreexpresión del alelo WT sdrM condujo a un aumento de ~2 veces en la actividad y resistencia de salida de DLX, mientras que los alelos sdrM1*, sdrM2* y sdrM3* mostraron un aumento de ~4 a 6 veces (Figura complementaria 10b, c) . Además, la sobreexpresión de sepA y lmrS no condujo a un aumento significativo en la resistencia a DLX, y la sobreexpresión de las 3 bombas de expulsión condujo a una resistencia similar a la sobreexpresión del alelo WT sdrM, lo que indica que la sobreexpresión de sdrM es probablemente el principal contribuyente a la resistencia a DLX causada por las amplificaciones genómicas (Fig. 10b complementaria).

La inestabilidad de la amplificación comúnmente provoca cambios en el número de copias y, en consecuencia, en la expresión, lo que puede depender de la fuerza selectiva de las condiciones ambientales12,14. Para probar la estabilidad de la amplificación, pasamos 1.7a y 6c en dos concentraciones de DLX, así como en medios libres de antibióticos durante dos días y determinamos la cobertura de lectura de sdrM para cada paso mediante la secuenciación del genoma completo. El número de copias de sdrM aumentó al pasar por DLX y disminuyó al pasar sin el antibiótico, lo que indica que el número de copias de sdrM, y probablemente su expresión, en las amplificaciones genómicas depende del nivel de exposición a DLX (Fig. 4a, b) . Además, la frecuencia de las dos mutaciones en el alelo sdrM3* (mutación de la secuencia de codificación A268S y una mutación aguas arriba) en 6c aumentó con el paso de DLX y disminuyó con el paso en los medios libres de antibióticos (Fig. 4a). Los aislamientos que se habían pasado durante dos días en la concentración más alta de DLX y tenían un número de copias de amplificación más alto, también mostraron un aumento de ~2 veces en la resistencia a DLX para 6c y un aumento leve para 1.7a (Fig. 4c, d ).

a Número de copias de sdrM y las frecuencias alélicas de las dos mutaciones que constituyen el alelo sdrM3* en 6c al pasar en medio sin DLX o dos concentraciones de DLX. b Copie el número de sdrM en 1.7a al pasar en medio sin DLX o dos concentraciones de DLX. Se muestran los datos de dos experimentos de pases independientes para ambos. CIM de DLX c, d en M63 de las poblaciones 6c y 1.7a después del segundo pase sin DLX, 4 μg/ml de DLX (DLX 4) o c 6 μg/ml de DLX (DLX 6) para 6c y d 8 μg/ml DLX (DLX 8) para 1.7a. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de dos réplicas biológicas, cada una de dos experimentos de pases independientes. e CIM de WT, 1.7a o 1.7a cultivadas durante la noche en 2 μg/ml de DLX (1.7a_DLX) para los antibióticos indicados en MH2. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. f CIM de estreptomicina de las cepas con sobreexpresión de pKK30 en MH2. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de cuatro réplicas biológicas. Se muestra la significación para la comparación con a–d el respectivo control sin DLX, e WT y f la cepa que lleva el vector vacío, según lo probado por un ANOVA unidireccional con la prueba de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (*P < 0.05, * *P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). a Para 'cobertura sdrM relativa' DLX 4 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,0012, pasaje 2 = 0,0067, DLX 6 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,001, pasaje 2 = 0,0018; para 'frecuencia alélica de A268S' DLX 4 μg/ml: P para pasaje 1 = 0,0052, pasaje 2 = 0,0164, DLX 6 μg/ml: P para pasaje 1 = 0,0052, pasaje 2 = 0,0097; y para 'frecuencia alélica de mutación intergénica' DLX 4 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,0018, DLX 6 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,0018; b, DLX 4 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,0312, pasaje 2 = 0,0020 y DLX 8 μg/ml: P para el pasaje 1 = 0,0092; dP para DLX 8 μg/ml = 0,048; e, acriflavina: P para 1,7a = 0,0025, 1,7a_DLX = 0,0002; cloranfenicol: P para 1.7a_DLX = 0.0035; fP para sdrM+lmrS+sepA = 0,0001. Los datos de origen se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Dada la presencia de tres bombas de eflujo en la amplificación, y su alta expresión resultante, probamos la resistencia de 1.7a cultivado con y sin DLX, frente a un panel de diferentes antibióticos. Si bien no observamos una mayor resistencia contra la mayoría de los antibióticos, el 1.7a cultivado en DLX mostró resistencia cruzada contra el aminoglucósido estreptomicina (Fig. 4e). Además, la sobreexpresión de las tres bombas de eflujo, pero no de sdrM sola, dio como resultado un aumento similar en la resistencia a la estreptomicina (Fig. 4f), lo que indica que la resistencia a la estreptomicina también requería una mayor expresión de lmrS y sepA.

La cepa sdrM::Tn no tuvo mutaciones adicionales en comparación con WT, mostró un crecimiento similar al de WT en M63 (Fig. 11a, b complementarias) y tuvo una MIC ~ 2 veces más baja que WT (Fig. 5a), lo que indica que SdrM contribuye al nivel de resistencia intrínseca a DLX de la cepa WT MRSA. Para comprender el papel de sdrM en la selección de las amplificaciones genómicas, desarrollamos tres poblaciones independientes, cada una de las cepas mutantes de transposones sdrM::Tn y WT (como control), en concentraciones crecientes de DLX, similar a nuestra evolución original. Verificamos que la inserción del transposón fue estable durante la evolución en las tres poblaciones evolucionadas sdrM :: Tn (Fig. 11c complementaria). Durante la evolución, las poblaciones crecieron en concentraciones de DLX ~ 640–1000x las CIM respectivas, y las poblaciones evolucionadas terminales tanto para WT como para sdrM :: Tn mostraron CIM de DLX altas (Fig. 11d complementaria). Vimos amplificaciones genómicas del locus sdrM en 2 de las tres poblaciones WT evolucionadas de forma independiente. Si bien la tercera población también mostró uniones asociadas con la amplificación, el aumento del número de copias fue inferior a nuestro umbral de 1,3 veces para indicar la presencia de una amplificación. Cada población WT tenía un nuevo tipo de amplificación que no se veía en la evolución original (Conjunto de datos complementario 4). Sin embargo, ninguna de las poblaciones sdrM::Tn tenía estas amplificaciones (Fig. 5b). Además, a diferencia de las poblaciones WT, todas las poblaciones secuenciadas de los pasajes intermedios y terminales de las evoluciones sdrM::Tn tenían mutaciones tanto en la enzima ADN girasa como en la topoisomerasa IV, lo que sugiere que la alta resistencia a DLX se debió a mutaciones de doble objetivo, a diferencia de a amplificaciones (Fig. 5b).

a DLX MIC de las cepas WT y sdrM::Tn en M63. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. Se muestra la significancia para la comparación con el WT según lo probado por una prueba t de dos colas no pareadas (*P = 0.0112). b Se muestra la presencia de mutaciones en genes que codifican subunidades de ADN girasa (gyrA, gyrB) y subunidades de ADN topoisomerasa IV (parC, parE), los tres alelos mutantes sdrM1*, sdrM2* y sdrM3*, y una amplificación genómica que contiene sdrM. para poblaciones de pasajes intermedios de tres poblaciones evolucionadas independientemente, cada una de las cepas WT y sdrM::Tn. c La fracción de supervivencia para los aislamientos indicados en múltiples concentraciones de DLX en comparación con un control sin DLX, medida como ufc/ml en las placas respectivas. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. d Porcentaje de las 12 poblaciones independientes de las cepas indicadas que desarrollaron resistencia a DLX con el tiempo en 2,5 veces las CIM de DLX respectivas (0,55 µg/ml para WT y 0,32 µg/ml para sdrM::Tn). Los datos de origen para (a, c, d) se proporcionan en el archivo de datos de origen.

Se sabe que las amplificaciones son inestables y comúnmente subyacen a la heterorresistencia a los antibióticos en las poblaciones43,44, mientras que se prevé que la resistencia debida a cambios en la secuencia de ADN sea más estable y homogénea. Por lo tanto, probamos la heterogeneidad de la población en busca de resistencia a los antibióticos en los aislados evolucionados 1.7a y 6c que tienen amplificaciones genómicas pero sin mutaciones diana canónicas, así como un aislado del paso final de una población sdrM::Tn evolucionada que tiene mutaciones en gyrA, gyrB y parE (Fig. 5b, Conjunto de datos complementario 2). Cultivamos los aislamientos durante la noche en medios libres de antibióticos y luego determinamos la fracción de la población que podría crecer en diferentes concentraciones de DLX. Observamos que mientras que el aislado evolucionado sdrM::Tn (Tn_3b) mostró ~100 % de resistencia a DLX en todas las concentraciones probadas, 1.7a y 6c mostraron heterogeneidad en la población, donde solo ~10 % o menos células eran resistentes a DLX (Fig. 5c) .

La presencia de mutaciones en ambas enzimas objetivo en todas las poblaciones sdrM::Tn evolucionadas (Fig. 5b) sugirió que, en ausencia de sdrM, las mutaciones en ambos objetivos son esenciales para una alta resistencia a DLX. Por lo tanto, probamos si la presencia de sdrM afectó la capacidad de evolución de la resistencia a DLX, de manera similar al experimento que probó los alelos sdrM evolucionados (Fig. 2c). Evolucionamos 12 poblaciones independientes de WT y sdrM::Tn en concentraciones fijas de DLX que eran 2,5 veces la MIC respectiva para cada cepa (0,55 μg/ml para WT y 0,32 μg/ml para sdrM::Tn), lo que permite un día adicional de crecimiento en el día 5 para ayudar en la evolución de la resistencia. Mientras que 5 de las 12 poblaciones WT desarrollaron resistencia a DLX en 6 días, solo 1 de 12 poblaciones sdrM::Tn desarrollaron resistencia en 8 días, lo que indica que la presencia de sdrM aumenta la capacidad de evolución de la resistencia a DLX (Fig. 5d).

Probamos dos aislamientos clínicos de S. aureus para determinar la incidencia de mutaciones sdrM y la amplificación tras la evolución de la resistencia a DLX. Los dos aislados clínicos de S. aureus se aislaron originalmente de dos pacientes con fibrosis quística. CF001 es una cepa MRSA del complejo clonal 8 (CC8) secuencia tipo 8 (ST8) y CF106 es una cepa CC1 ST188 MSSA (Conjunto de datos complementario 5). Mientras que CF001 tenía un DLX MIC ~2 veces más bajo que nuestra cepa JE2 WT, el DLX MIC de CF106 era ~50 veces más bajo que JE2 (Fig. 6a). Evolucionamos tres poblaciones independientes, cada una de CF001 y CF106 en concentraciones crecientes de DLX, y secuenciamos poblaciones de pasajes intermedios (Fig. 6b). Dos de las tres poblaciones de CF001 y CF106 tenían el alelo sdrM2*, mientras que todas las poblaciones evolucionadas de CF001 y CF106 tenían amplificaciones genómicas de sdrM.

a CIM DLX de JE2 (WT) y los dos aislados clínicos CF001 y CF106. Los datos que se muestran son la media ± desviación estándar de tres réplicas biológicas. Se muestra la significación para la comparación con el WT según lo probado por un ANOVA unidireccional con la prueba de Holm-Sidak para comparaciones múltiples (**P = 0.0024, ****P < 0.0001). b Se muestra la presencia de mutaciones en genes que codifican subunidades de ADN girasa (gyrA, gyrB) y subunidades de ADN topoisomerasa IV (parC, parE), los tres alelos mutantes sdrM1*, sdrM2* y sdrM3*, y una amplificación genómica que contiene sdrM. para poblaciones de pasajes intermedios de tres poblaciones evolucionadas independientemente de los aislados clínicos CF001 y CF106. Los datos de origen de a se proporcionan en el archivo de datos de origen.

La resistencia contra los antibióticos con más de un objetivo celular probablemente requiera múltiples mutaciones en una célula y, por lo tanto, se prevé que sea poco frecuente. Sin embargo, los caminos evolutivos que conducen a la resistencia contra tales antibióticos no están bien caracterizados. En este estudio, demostramos que la evolución de MRSA tras la exposición a la fluoroquinolona DLX de 4.ª generación de orientación dual condujo a la resistencia a través de la secuencia de codificación y mutaciones aguas arriba en sdrM, el gen que codifica una bomba de eflujo de la superfamilia facilitadora principal pobremente caracterizada, así como amplificaciones génicas de sdrM. Además, la presencia de dos bombas de eflujo adicionales adyacentes al locus sdrM y, en consecuencia, su autostop en la amplificación genómica, condujo a una resistencia cruzada contra el aminoglucósido estreptomicina. En ausencia de sdrM, las cepas requerían mutaciones en ambos objetivos canónicos, la ADN girasa y la topoisomerasa IV, para lograr la resistencia a DLX y, por lo tanto, tenían una capacidad de evolución reducida de la resistencia a DLX. Las mutaciones y amplificaciones de sdrM proporcionaron así un camino adaptativo más accesible a la alta resistencia a DLX. Nuestros resultados sugieren que los antibióticos con objetivos múltiples pueden conducir inadvertidamente a trayectorias adaptativas alternativas que no solo permiten una rápida evolución de la resistencia, sino que también conducen a cambios desfavorables adicionales en el panorama de la aptitud bacteriana.

Se cree que las bombas de eflujo brindan una protección rápida a las células tras la exposición a los antibióticos, y las mutaciones de las bombas de eflujo se asocian comúnmente con la resistencia a los antibióticos45. Varias bombas de eflujo de múltiples familias de proteínas están presentes en MRSA. Las bombas de la familia MFS incluyen NorA, NorB, NorC, LmrS, MdeA y SdrM codificadas cromosómicamente, y la sobreexpresión basada en plásmidos de estas bombas puede conferir resistencia a las fluoroquinolonas, compuestos de amonio cuaternario y colorantes46,47. Mientras que las mutaciones en norA se han asociado con la evolución de la resistencia a los antibióticos, especialmente contra las fluoroquinolonas48, las mutaciones de sdrM no se han implicado previamente. Por lo tanto, nuestro estudio muestra que las bombas de salida menos bien caracterizadas pueden desempeñar un papel en la adquisición de AMR, especialmente contra los antimicrobianos recientemente desarrollados. Además, se había sugerido anteriormente que la sobreexpresión basada en plásmidos de lmrS y sepA en E. coli o en una cepa de S. aureus sensible a la meticilina podría conducir a una mayor resistencia contra múltiples antibióticos, incluidos linezolid, eritromicina y kanamicina39,40,49. Sin embargo, no observamos resistencia cruzada contra estos antibióticos en nuestros aislados evolucionados que sobreexpresaron estas bombas de expulsión, lo que indica que esta resistencia puede ser específica de E. coli o de la cepa de S. aureus.

Las mutaciones de la bomba de expulsión asociadas a la resistencia a los antibióticos suelen aumentar la expresión de la bomba de expulsión, lo que reduce las concentraciones de antibiótico dentro de la célula. Tales mutaciones se localizan con mayor frecuencia en la región promotora o en un represor de la bomba, aunque también se han observado amplificaciones genómicas de las bombas de eflujo50,51. En nuestras evoluciones, no identificamos ninguna mutación del represor transcripcional que aumentaría la expresión de sdrM, y solo una población tenía una mutación aguas arriba de sdrM, mientras que las amplificaciones de sdrM eran comunes en las diez poblaciones evolucionadas de forma independiente. Esto sugiere que el aumento sustancial en la expresión de sdrM requerido para una alta resistencia a DLX es en gran medida inaccesible a través de mutaciones de promotores o represores. En los aislados evolucionados con amplificaciones, los niveles de expresión de sdrM y las bombas de eflujo adyacentes lmrS y sepA fueron mucho más altos en comparación con el número de copias de los genes codificantes (Fig. 3c, d), lo que sugiere que la regulación de estos genes está alterada en el amplificación. Curiosamente, un grupo de genes tRNA-rRNA, que normalmente se expresan de forma extremadamente alta, se encuentra aguas abajo de sdrM, lmrS y sepA, pero se coloca aguas arriba de las copias amplificadas de los genes que codifican la bomba de eflujo. Esto plantea la posibilidad de que la transcripción de lectura completa de los genes tRNA-rRNA pueda dar como resultado la expresión de la bomba de salida altamente aumentada que observamos en nuestros aislados evolucionados que contienen amplificaciones, similar a una observación previa en Streptococcus pneumoniae51.

También se ha demostrado que las mutaciones de la secuencia de codificación en las bombas de expulsión aumentan la resistencia a los antibióticos en Pseudomonas aeruginosa (mexB, mexY), Klebsiella pneumoniae (kmrA) y Neisseria gonorrhoeae (mtrD), probablemente debido a una mayor afinidad por el antibiótico52,53,54. Estudios recientes han sugerido que una mayor expresión de las bombas de expulsión también podría facilitar la resistencia a los antibióticos al aumentar la tasa de mutación55,56, permitiendo la expresión de determinantes de resistencia tras la adquisición del plásmido57, o promoviendo la selección de mutaciones de resistencia debido a una mayor aptitud tras la exposición a los antibióticos de cepas que portan la mutaciones de resistencia y sobreexpresión de bombas de eflujo58. También encontramos que las mutaciones de la secuencia de codificación en el bolsillo de unión de SdrM aumentaron la resistencia y el flujo de salida de DLX, probablemente al alterar la unión a DLX. La mutación aguas arriba de sdrM3* probablemente condujo a niveles elevados de la bomba de salida de sdrM, lo que a su vez condujo a un mayor aumento en la salida de DLX y la resistencia (Fig. 2a, b). Además, el aumento moderado en la resistencia a DLX de los alelos mutantes sdrM provocó una mayor capacidad de evolución de la resistencia a DLX en comparación con WT, lo que sugiere que las mutaciones de la bomba de expulsión de la secuencia codificante también podrían facilitar la evolución de mutaciones adicionales que conducen a niveles más altos de resistencia. , posiblemente debido a un aumento sinérgico en la resistencia, o una aptitud física elevada, de los mutantes combinados. Finalmente, mostramos que la amplificación de sdrM proporcionaba una ruta adaptativa de un solo paso a la resistencia a DLX, mientras que al menos dos mutaciones, en las enzimas ADN girasa y topoisomerasa IV, eran necesarias para una alta resistencia a DLX en ausencia de sdrM, y la presencia de un gen sdrM funcional, por lo tanto, aumentó la capacidad de evolución de la resistencia a DLX. Si bien el nivel final de resistencia a DLX alcanzado fue similar entre las cepas WT y sdrM::Tn (Fig. 11d complementaria), la presencia de sdrM en WT permitió una evolución más rápida y frecuente de la resistencia a DLX (Fig. 5d). Dado que se cree que las amplificaciones genómicas son mucho más comunes que las mutaciones en la secuencia genómica12,14, es probable que la combinación de una mutación y amplificación de la secuencia codificante de sdrM también surgiera con más frecuencia que la combinación de mutaciones de la secuencia codificante en las dos enzimas diana.

Múltiples mutaciones contribuyeron a la resistencia a DLX en nuestras poblaciones evolucionadas, de las cuales los determinantes más importantes son probablemente los alelos evolucionados de sdrM, las amplificaciones de sdrM y las mutaciones canónicas en las subunidades de ADN girasa y topoisomerasa. Dentro de estas categorías, los alelos específicos sdrM, gyrA, gyrB, parC y parE presentes, así como el número de copias de amplificación de sdrM, probablemente afecten los niveles exactos de resistencia observados. Las mutaciones individuales en las enzimas girasa o topoisomerasa, así como las copias individuales de los alelos sdrM evolucionados conducen a un aumento de 2 a 4 veces en el DLX MIC (Figura complementaria 1b, Figura 2a), mientras que las mutaciones tanto en el ADN Las enzimas girasa y topoisomerasa IV probablemente conducen a CIM DLX altas, 40 a 250 veces más altas que la WT, como se ve en las poblaciones evolucionadas de sdrM::Tn (Fig. 5b). Las amplificaciones de sdrM conducen de manera similar a una alta resistencia a DLX, lo que da como resultado CIM de DLX de 5 a 100 veces más altas que las de WT (Fig. 3e). Observamos una resistencia a DLX de 3 a 9 veces mayor en nuestras cepas de sobreexpresión de sdrM (Fig. 10b complementaria), que fue más baja que la resistencia en los aislados evolucionados 1.7a, 4.2a y 6c (Fig. 3e). Esto probablemente se debió a la expresión de sdrM significativamente más alta observada en algunos de estos aislados evolucionados (Fig. 3d, Fig. 10a complementaria), así como al aumento en el número de copias de la amplificación de sdrM tras la exposición a DLX y los aumentos posteriores en la expresión de sdrM y CIM DLX (Fig. 4). Es poco probable que la sobreexpresión de sdrM basada en plásmidos recapitule la naturaleza dinámica de las amplificaciones genómicas, lo que impide una comparación directa de los niveles de resistencia entre los aislados evolucionados y los mutantes de sobreexpresión y sustitución de alelos construidos.

Existe una diversidad significativa entre las cepas de S. aureus que se aíslan en la clínica59, pero nuestros experimentos muestran que tras la exposición a DLX, la selección para amplificaciones genómicas de sdrM, y al menos el alelo sdrM2*, es común incluso en aislados clínicos de diferentes complejos clonales. DLX ha sido aprobado recientemente (en 2017) para uso clínico por la FDA26 y, por lo tanto, es poco probable que la selección de resistencia a DLX en la clínica y la posterior secuenciación de aislados resistentes sean comunes todavía. Los pocos aislamientos clínicos de S. aureus resistentes a DLX que se identificaron y secuenciaron en un estudio anterior tenían mutaciones tanto en la enzima ADN girasa como en la topoisomerasa IV28. Sin embargo, estos aislamientos se recolectaron antes de la aprobación de DLX y el uso clínico y, por lo tanto, se desconocen las presiones selectivas y las rutas mutacionales que llevaron a la adquisición de las mutaciones objetivo. Otro estudio reciente que examinó aislados clínicos de S. aureus resistentes a DLX también identificó mutaciones en las subunidades IV de la ADN girasa y la topoisomerasa, e indicó un papel de las bombas de expulsión en la resistencia a DLX en al menos un aislado29. Nuestro análisis de más de 63 000 genomas de S. aureus también mostró que, si bien las mutaciones A268S e Y363H son raras, son abundantes otras mutaciones en SdrM, incluso en los residuos que se prevé que estén en el bolsillo de unión. Estas mutaciones pueden afectar potencialmente la resistencia de S. aureus y la evolución de la resistencia a DLX y otros antibióticos.

Se estima que las duplicaciones y amplificaciones genómicas están presentes en el 10 % de las células bacterianas en cultivos en crecimiento y, debido a su alta frecuencia, se cree que desempeñan un papel importante en la adaptación temprana al estrés, incluida la resistencia a los antibióticos12,14. Nuestro estudio demuestra que las amplificaciones genómicas de las bombas de eflujo pueden conducir a la resistencia a los antibióticos y pueden ser los primeros pasos de caminos evolutivos que permitan la rápida evolución de mutaciones de resistencia más estables, especialmente cuando se requieren múltiples mutaciones de este tipo para altos niveles de resistencia.

Las amplificaciones genómicas suelen ser inestables y con frecuencia se pierden en ausencia de presión selectiva, lo que lleva a la heterogeneidad de la población y a la heterorresistencia a los antibióticos43,44. Observamos una inestabilidad de amplificación similar en nuestro estudio, lo que lleva a la heterogeneidad de la población de resistencia a DLX. Además, el tratamiento con altas concentraciones de DLX condujo a un mayor número de copias de amplificación y, en consecuencia, aumentó la resistencia a DLX, así como la resistencia cruzada contra la estreptomicina. Rara vez se observó heterorresistencia contra las fluoroquinolonas en aislamientos clínicos de cuatro patógenos en un estudio anterior y esto se atribuyó a la resistencia que requería mutaciones específicas44. Sin embargo, nuestro estudio muestra que en MRSA, las amplificaciones genómicas de las bombas de expulsión pueden conducir a una alta resistencia a las fluoroquinolonas. La inestabilidad de las amplificaciones genómicas probablemente conduce a su infradetección en estudios clínicos y de laboratorio y, por lo tanto, probablemente se subestima su papel en la resistencia a los antibióticos.

Cuantificamos el número de copias de la amplificación mediante qPCR en el ADN genómico, así como la profundidad de cobertura en nuestras muestras de secuenciación del genoma completo. Sin embargo, dada la inestabilidad de la amplificación y la consiguiente heterogeneidad incluso dentro de una población isogénica de una sola cepa, puede ser necesaria una secuenciación de lectura larga con una alta profundidad de cobertura para proporcionar una medición más precisa de la distribución del número de copias de la amplificación en una población.

Curiosamente, se observaron 16 tipos distintos de amplificación genómica de sdrM en nuestras 13 poblaciones WT independientes, y las amplificaciones fueron dinámicas dentro de cada población, lo que destaca aún más su inestabilidad. Además, observamos que surgía y se seleccionaba la misma amplificación en múltiples poblaciones independientes, lo que sugiere que las rupturas y amplificaciones del ADN pueden ocurrir preferentemente en ciertos sitios genómicos. La secuencia de las uniones de amplificación consistía en una microhomología de 13 pb como máximo o ninguna homología, que es inferior al umbral de 20–40 pb requerido para la recombinación mediada por RecA14. Esto sugiere que la duplicación inicial en nuestras poblaciones evolucionadas probablemente se produjo a través de la unión de extremos no homólogos o la unión de extremos alternativos, que no se han informado en S. aureus hasta la fecha60.

Las roturas de ADN contribuyen a la formación de amplificaciones genómicas, tanto en bacterias como en sistemas eucariotas14,61. Las enzimas ADN girasa y topoisomerasa IV alivian el estrés topológico en el ADN, generando rupturas de doble cadena de ADN de corta duración, que luego se vuelven a ligar. Las fluoroquinolonas generalmente se unen a la girasa de ADN o la topoisomerasa IV en un complejo con el ADN y pueden promover la escisión del ADN e inhibir fuertemente la religación de los extremos del ADN, lo que resulta en un aumento de las roturas de doble cadena del ADN62,63. Por lo tanto, los antibióticos de fluoroquinolona pueden promover la formación de amplificaciones genómicas y, en nuestro estudio, observamos una generación y selección generalizadas de amplificaciones genómicas que contienen sdrM tras la exposición a DLX. Un estudio reciente también mostró que la exposición al veneno de la ADN girasa albicidina, que también bloquea la religación del ADN64, condujo a amplificaciones genómicas de una proteína inhibidora en Salmonella Typhimurium y Escherichia coli, y proporcionó resistencia a la albicidina, lo que indica además que la inhibición de las enzimas topoisomerasas del ADN puede ayudar en la formación de amplificaciones genómicas65.

Se cree que los antibióticos multiobjetivo o las combinaciones de fármacos reducen la frecuencia de la resistencia a los antibióticos. Sin embargo, nuestro estudio indica que si uno de los objetivos de tales tratamientos es la enzima ADN girasa o topoisomerasa, en su lugar puede seleccionar amplificaciones genéticas que surgen debido a rupturas en el ADN y conducen a una rápida evolución de la resistencia, y estas amplificaciones también pueden conducir a consecuencias de aptitud adicionales imprevistas, incluida la resistencia cruzada. Por lo tanto, es necesaria una mejor comprensión de los factores genéticos y ambientales que afectan las amplificaciones genómicas, así como las trayectorias adaptativas que son accesibles debido a la selección de tales amplificaciones, especialmente en entornos clínicos, para informar nuevas terapias antimicrobianas.

Todas las cepas y plásmidos utilizados en este trabajo se describen en la Tabla complementaria 1. Los aislados clínicos se obtuvieron del Cystic Fibrosis Foundation Isolate Core en el Seattle Children's Hospital y se aislaron originalmente de dos pacientes con fibrosis quística diferentes. La distribución de estos aislamientos está cubierta por un protocolo IRB #14977 aprobado por Seattle Children's.

Todos los experimentos en medios líquidos se llevaron a cabo a 37 °C, con agitación a 300 rpm, en medios M63 modificados (13,6 g/L KH2PO4, 2 g/L (NH4)2SO4, 0,4 μM de citrato férrico, 1 mM de MgSO4; pH ajustado a 7.0 con KOH) suplementado con 0,3 % de glucosa, 0,1 μg/ml de biotina, 2 μg/ml de ácido nicotínico, 1 × suplemento EZ (Teknova) y 1 × solución ACGU (Teknova), o en Mueller Hinton Broth 2 (MH2) (Millipore sigma) con o sin 1× ACGU. Para la clonación y la construcción de cepas, las cepas se cultivaron en medio líquido LB (10 g/L de bactotriptona, 5 g/L de extracto de levadura, 10 g/L de NaCl) o en placas LB (que contenían 15 g/L de agar), complementado con el antibiótico adecuado (cloranfenicol 10 μg/ml, ampicilina 50 μg/ml, trimetoprima 10 μg/ml) o paraclorofenilalanina al 0,4 % (PCPA) para la contraselección. Las placas MH2 se prepararon con agar MH2 (Millipore sigma) y se complementaron adecuadamente con 1x ACGU y DLX (ya sea 0,5, 1 o 2 μg/ml).

Diez poblaciones independientes de células S. aureus JE2 se cultivaron con agitación a 300 rpm a 37 °C en medios M63 modificados, en presencia de concentraciones crecientes de DLX, con una dilución diaria de 50 a 100 veces en tubos con tapa a presión de 14 ml que contenían 2 ml de medio fresco con DLX. La evolución comenzó entre 0,05 y 0,25 μg/ml de DLX, y la concentración aumentó entre 1,5 y 2 veces en cada exposición. Si las cepas no crecían a la concentración inicial, se escogía una concentración de DLX más baja para iniciar la evolución. Durante la evolución, si una población no mostraba un crecimiento visible después de un día, se le permitía un día adicional de crecimiento. Si aún no había crecimiento después de dos días, la evolución se reinició al paso anterior y se eligió un incremento de DLX más pequeño para el paso siguiente. La evolución se detuvo a 128 μg/ml o en cualquier pase después de 8 μg/ml si las poblaciones no crecían en la concentración posterior en dos intentos. Los detalles de las poblaciones se encuentran en el Conjunto de datos complementarios 1.

Se usó una configuración similar para evolucionar el mutante sdrM::Tn, donde tres poblaciones independientes, cada una de sdrM::Tn y WT, evolucionaron en paralelo, comenzando con una concentración de DLX de 0,1 μg/ml, y las concentraciones aumentaron 1,5–2 -doblar en cada exposición. De manera similar, para la evolución de los aislados clínicos, se desarrollaron en paralelo tres poblaciones independientes de CF001 y CF106 a partir de una concentración de DLX de 0,1 μg/ml para CF001 y 0,002 μg/ml para CF106. Las concentraciones aumentaron de 1,5 a 2 veces en cada exposición. La evolución se detuvo como se describe anteriormente.

Cada una de las diez poblaciones evolucionadas de forma independiente desde la evolución inicial se marcó de P1-P10. Por lo tanto, P1 significa la primera población que evolucionó de forma independiente. Introducimos un punto y un segundo número que representa el número de pasaje, por ejemplo, P1.7 indica el 7° pasaje de la 1° población evolucionada. Las letras que aparecen al final de cada número indican que fue un aislado, por ejemplo, 1.7a indica un aislado extraído de la población P1.7. Los aislados del pasaje final se representan como el número de población y una letra, por ejemplo, 1a es un aislado del pasaje final en la población P1.

El ADN genómico se preparó a partir de poblaciones y aislamientos seleccionados utilizando el kit Qiagen DNeasy Blood and Tissue. Luego, se prepararon bibliotecas indexadas de un solo extremo o de dos extremos utilizando el kit de preparación de bibliotecas de ADN Illumina Nextera XT y se secuenciaron en un secuenciador Illumina MiSeq o Nextseq 500. Los datos se analizaron como se describe anteriormente66,67, donde los adaptadores de Illumina se quitaron con cutadapt v4.068, las lecturas se recortaron con trimmomatic v0.3969, o ambos pasos se realizaron con fastp v0.23.267, y las mutaciones en las poblaciones evolucionadas y los aislamientos se identificaron utilizando breseq v0.37.170. Las mutaciones identificadas en las poblaciones evolucionadas en los genes que codifican los objetivos canónicos o las bombas de expulsión en comparación con la cepa parental, así como todas las mutaciones presentes en las poblaciones del paso terminal de cada población evolucionada de forma independiente se enumeran en el Conjunto de datos complementario 2. Las mutaciones identificadas en se consideró como presente una población con una frecuencia de al menos el 30%.

Los genomas de los aislamientos clínicos CF001 y CF106 se ensamblaron utilizando Unicycler v0.4.871 en PATRIC72 (ahora integrado en el Centro de Recursos de Bioinformática Bacteriana y Viral). Los contigs ensamblados luego se anotaron usando Prokka v1.14.673. Estos genomas anotados se usaron como referencia para identificar mutaciones en las respectivas poblaciones evolucionadas usando breseq.

La MLST de CF001 y CF106 se realizó utilizando la base de datos en línea PubMLST (pubmlst.org)74, y la tipificación de SCCmec se realizó mediante Staphopia-sccmec75.

La profundidad de cobertura de cada par de bases en los datos de secuenciación del genoma completo se determinó mediante el comando BAM2COV en breseq v0.37.1. La cobertura de todos los pares de bases se sumó para todo el genoma o cada gen de interés y luego se dividió por la longitud de la secuencia (número de pares de bases). A continuación, se determinó el cambio en la cobertura dividiendo el número correspondiente de lecturas por par de bases del gen con el del genoma completo. Para identificar las amplificaciones de sdrM, las muestras debían tener una unión genómica que condujera a la amplificación de sdrM (según lo determinado por breseq) y alcanzar un umbral para la cobertura de lectura relativa de sdrM. Para los aislamientos, la cobertura relativa de sdrM tenía que ser al menos 2 veces el valor medio de WT (de tres réplicas biológicas), mientras que para las poblaciones, la cobertura relativa de sdrM tenía que ser al menos 1,3 veces la cobertura media de WT (para permitir la población). heterogeneidad). Para cada tipo de amplificación, se verificó al menos un caso mediante amplificación por PCR de la nueva unión seguida de secuenciación de Sanger.

Para los datos que se muestran en la Fig. 9 complementaria, calculamos la cobertura normalizada de sdrM, lmrS, sepA y rpoC como la suma de las lecturas asignadas al gen divididas por la longitud del gen. A continuación, la cobertura normalizada de la bomba de eflujo se dividió por la de rpoC y, para cada aislado evolucionado, se normalizó al valor de WT para obtener el cambio de cobertura.

Para los aislamientos clínicos, como los genomas se ensamblaron en contigs, comparamos la cobertura de sdrM con el contig que lo contiene. La profundidad de cobertura de cada par de bases en el contig se determinó como se indicó anteriormente. El cambio de pliegue en la cobertura de sdrM se determinó dividiendo el número de lecturas por par de bases de sdrM por el del contig. Los criterios para identificar una amplificación fueron los mismos que los anteriores, excepto que la cobertura relativa de sdrM se comparó con el valor del aislado clínico parental respectivo.

El ADN genómico se extrajo de los aislados evolucionados y los alelos evolucionados se amplificaron mediante PCR y se clonaron en pIMAY* digerido con BamHI y EcoRI, utilizando el ensamblaje de Gibson76. El perfil de metilación de los plásmidos se comparó con el de S. aureus después de electroporar y extraer los plásmidos construidos de E. coli IM08B77. La extracción de plásmidos se realizó con el kit Qiagen Plasmid MIDI y los plásmidos se concentraron con Savant SpeedVac SPD1030. El reemplazo alélico se llevó a cabo en S. aureus JE2 como se describe76. Brevemente, los plásmidos se sometieron a electroporación en células de S. aureus JE2 y se sembraron a 30 °C en LB Agar + cloranfenicol. Las colonias transformadas se cultivaron con agitación a 37 °C en medio LB + cloranfenicol durante dos noches, con una dilución 1:1000 en medio fresco después de la primera noche. Al día siguiente, las células se sembraron en placas de agar LB + cloranfenicol, y se analizó la integración de las colonias mediante PCR con los cebadores de integración enumerados en la Tabla complementaria 2. Para la escisión del plásmido, las colonias que mostraron integración se cultivaron en medio LB a 25 °C con agitación durante dos noches, con una dilución de 1:1000 después de la primera noche. A continuación, las células se sembraron en placas LB que contenían PCPA al 0,4 % y las colonias se cribaron en función del tamaño, asumiendo que los tamaños más grandes indican la escisión del plásmido. Se sembraron entre 60 y 100 colonias grandes en placas LB con y sin cloranfenicol para identificar los clones sensibles al cloranfenicol. La presencia del alelo mutante se confirmó mediante la secuenciación de Sanger utilizando los cebadores de secuenciación (consulte la Tabla complementaria 2).

Se descargaron ensamblajes del genoma de 63 986 aislamientos de S. aureus de la base de datos de detección de patógenos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/), a la que se accedió el 19 de enero de 2023. Las secuencias FASTA se concatenaron y se La base de datos BLAST local se creó con el comando NCBI BLAST v2.13.0+ makeblastdb78. La secuencia de proteína de la secuencia JE2 SdrM se usó como una consulta para una búsqueda tblastn (BLAST traducida) en la base de datos local, y el resultado se analizó para todos los resultados que tenían una cobertura del 100 %, un porcentaje de identidad >85 % y un valor E < 10−6. Las frecuencias de aminoácidos para todas las posiciones se cuantificaron a partir de la salida BTOP de tblastn y se muestran en el Conjunto de datos complementario 3.

Para construir las cepas de sobreexpresión, los genes WT y los alelos mutantes sdrM se amplificaron por PCR y se clonaron en el vector pKK30 amplificado por PCR utilizando el ensamblaje de Gibson. El producto ensamblado por Gibson se sometió a electroporación en células electrocompetentes DH5α λ-pir de E. coli y se recuperó en placas de agar LB + trimetoprima. Los plásmidos se extrajeron de las cepas de E. coli y se electroporaron en S. aureus RN4220. Los plásmidos se extrajeron una vez más y se sometieron a electroporación en S. aureus JE2.

Las células se cultivaron durante 16 h en 2 ml de M63. Se añadieron 2 µl de estas células a 198 µl de M63 + 0,1 µg/ml de DLX en una placa de 96 pocillos. La fluorescencia de DLX (longitudes de onda de excitación y emisión de λexc = 395 nm y λem = 450 nm respectivamente) y la OD600 se midieron cada 30 min durante 19,5 h. Se tomaron lecturas de fondo para las células en M63 sin DLX o 0,1 µg/ml de DLX, y M63 solo sin DLX o 0,1 µg/ml de DLX. Dado que la fluorescencia sin procesar se observó solo en presencia de células (Fig. 4a complementaria), esto probablemente indica una acumulación de DLX dentro de las células y puede usarse como un indicador de DLX intracelular. Para permitir la comparación entre muestras, normalizamos la fluorescencia para la densidad celular y restamos la autofluorescencia de los medios y las células. La fluorescencia normalizada (fluorescencia/OD600) se calculó como,

Dado que la densidad celular es muy baja inicialmente y las células están en fase de retraso, la fluorescencia normalizada en los puntos de tiempo tempranos muestra una alta variabilidad debido a los valores bajos de los términos del denominador. Por lo tanto, mostramos los datos de las últimas 12,5 h en las figuras.

Para determinar las tasas de salida de DLX, consideramos un modelo matemático simplificado para capturar solo el aumento en la concentración de DLX dentro de las células. Dada la selección de mutaciones de sdrM y el efecto de la sobreexpresión de sdrM en la resistencia a DLX, asumimos que la salida de DLX dependía principalmente de la actividad de SdrM. Además, dado que SdrM es una bomba de eflujo y es poco probable que afecte el metabolismo o la degradación de DLX, estos procesos deberían ser similares en todas nuestras cepas probadas y, por lo tanto, no los incluimos en nuestro modelo. Definimos las siguientes ecuaciones diferenciales:

donde, Cin es la concentración de DLX dentro de la celda en el tiempo t, ρin es la tasa de entrada de DLX a la celda, Cout es la concentración de DLX fuera de la celda en el tiempo t, ρout es la tasa de salida de DLX de la celda y A = Cout (t = 0) es la concentración inicial de DLX que usamos para el experimento, 0,1 µg/ml (~0,226 µM). Asumimos que la vinculación y desvinculación de DLX ocurre muy rápido y no lo tomamos en cuenta en nuestras ecuaciones por simplicidad. Resolviendo las dos ecuaciones anteriores obtenemos:

Integrando esta ecuación diferencial ordinaria lineal de segundo orden con Cin (t = 0) = 0 obtenemos,

donde B es una constante arbitraria. Como la fluorescencia normalizada que determinamos con el ensayo de salida era un indicador de Cin, realizamos un ajuste por mínimos cuadrados de Cin con la fluorescencia normalizada frente al tiempo para sdrM::Tn, para determinar B y ρin, suponiendo que la tasa de salida ser igual a la tasa de entrada, ρin = ρout para el transposón mutante ya que SdrM está ausente y el transporte de DLX dentro y fuera de la célula será pasivo. Se asumió que los valores de mejor ajuste para B y ρin eran los mismos para las otras cepas. Sustituyendo estos valores, realizamos un ajuste de mínimos cuadrados para WT, sdrM1*, sdrM2* y sdrM3* para determinar los valores de mejor ajuste para las tasas de salida ρout para cada cepa. Como estábamos ajustando Cin a la fluorescencia normalizada, las unidades de las tasas de entrada y salida eran unidades arbitrarias/tiempo (horas).

DLX se diluyó dos veces en serie en una placa de fondo transparente plana Corning de 96 pocillos, para obtener ocho concentraciones. Las células cultivadas durante la noche en medio M63 o Mueller Hinton Broth 2 (MH2) se transfirieron a una dilución final de 1:5000 a la placa de 96 pocillos que contenía el antibiótico diluido en serie y se cultivaron a 37 °C con agitación durante 24 h. Después del crecimiento, se midió la DO600 de todos los pocillos utilizando un lector de microplacas Biotek Synergy H1. Las mediciones de OD600 para todas las concentraciones de DLX se trazaron frente a los valores de concentración de DLX y se ajustaron a una función de Gompertz modificada para determinar los valores exactos de MIC79. Para determinar las CIM de múltiples fármacos, WT se cultivó en caldo MH2 suplementado con 1x ACGU, y 1.7a se cultivó en MH2 suplementado con 1x ACGU con o sin 2 µg/ml de DLX durante la noche. Al día siguiente, las tres noches se lavaron dos veces en PBS 1x y se determinaron las CMI para todos los antibióticos. El medio MH2 se complementó con 1 × ACGU para experimentos con 1.7a, ya que pyrC, un gen involucrado en la síntesis de pirimidina, tenía una mutación de cambio de marco en 1.7a, lo que resultó en un crecimiento deficiente sin la suplementación con 1 × ACGU.

El ADN genómico se extrajo como se describe anteriormente. El ARN se extrajo de las células cultivadas durante la noche en M63 con el kit Total RNA Purification Plus (Norgen Biotek Corp) y el ADN se eliminó con el kit TURBO DNA-free™ (Invitrogen). El ADNc se sintetizó utilizando cebadores aleatorios y transcriptasa inversa Superscript III (Thermo Fisher Scientific). Las muestras de ADN genómico o ADNc se mezclaron con cebadores (consulte la Tabla complementaria 2) y Applied Biosystems Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Scientific) en una placa de reacción Microamp EnduraPlate Optical 384 Well Clear (Thermo Fisher Scientific) y qPCR o RT-qPCR , respectivamente, se ejecutó en una máquina de PCR en tiempo real QuantStudio 5 (Thermo Fisher Scientific). El gen rpoC se utilizó como control interno tanto para qPCR como para RT-qPCR80.

Se inocularon doce colonias independientes para cada cepa en una placa de 96 pocillos que contenía 200 μl de M63 fresco a 37 °C con agitación durante 24 h. Al día siguiente, se inocularon 10 μl de cada uno en 190 μl de M63 fresco que contenía 2,5 veces las respectivas CIM de DLX (sdrM::Tn a 0,32 μg/ml, WT a 0,55 μg/ml, sdrM1* y sdrM2* a 1 μg/ml). ml y sdrM3* a 1,75 μg/ml) y se cultivaron durante 23 h a 37 °C con agitación. Después de 23 h, se midió la DO600 y se transfirieron 10 μl de cada pozo a una placa de 96 pozos que contenía 190 μl de M63 y DLX frescos, y esto se repitió durante 5 a 14 días. Para la evolución de las cepas WT y sdrM::Tn (datos que se muestran en la Fig. 5e), las poblaciones se cultivaron durante 24 h adicionales después del día 5 sin transferencia, para permitir potencialmente un crecimiento y una evolución adicionales, para permitir las comparaciones entre las dos cepas Las poblaciones que tuvieron una DO600 ≥ 0.400 y mantuvieron este crecimiento de manera constante hasta el final del experimento se clasificaron como resistentes. El experimento se detenía si no había crecimiento durante tres días consecutivos en cualquiera de los pocillos.

El día 1, las cepas se inocularon en medio M63 fresco y se cultivaron durante 24 ha 37 °C con agitación sin DLX. El día 2, las células se diluyeron 1000 veces en tubos que contenían medio fresco sin antibiótico o DLX en las concentraciones apropiadas. El mismo proceso se repitió para el día 3, y para cada cepa hubo dos repeticiones. El ADN genómico se extrajo cada día y se realizó la secuenciación del genoma completo. El número de copias de sdrM se determinó como se describe anteriormente.

Las células se cultivaron durante la noche en caldo MH2 suplementado con 1x ACGU, y al día siguiente se colocaron diluciones en serie de los cultivos en placas de agar MH2 suplementadas con 1x ACGU, sin DLX, o que contenían DLX a 2 μg/ml, 1 μg /ml, o 0,5 μg/ml y se cultivó en una incubadora a 37 °C durante la noche. Al día siguiente se determinaron las unidades formadoras de colonias.

Las células se cultivaron durante la noche en M63, se diluyeron 1:2500 en M63 fresco y se transfirieron 200 µl a una placa de 96 pocillos. Las placas se incubaron en un lector de microplacas Biotek Synergy H1 a 37 °C con agitación continua a 807 ciclos por minuto, y se midió la DO600 de la placa cada 30 min durante 24 h. Para determinar la densidad celular, se colocaron diluciones en serie de cultivos durante la noche en placas de agar LB y se cultivaron en una incubadora a 37 °C durante la noche. Al día siguiente se determinaron las unidades formadoras de colonias.

Las pruebas estadísticas y el análisis se realizaron en GraphPad Prism v8.4.3.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los ensamblajes del genoma de los aislamientos de S. aureus para analizar la variabilidad alélica de SdrM se descargaron de la base de datos de detección de patógenos del NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pathogens/). Los datos de secuenciación del genoma completo de este estudio se han depositado en el Archivo de Lectura Corta (SRA) del NCBI, asociado con el BioProyecto PRJNA904786. Los datos fuente se proporcionan en este documento.

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Nos gustaría agradecer al Centro de Genómica de Investigación del Cáncer Core por la preparación y secuenciación de la biblioteca de secuenciación del genoma completo, y al laboratorio Bose (Centro Médico de la Universidad de Kansas) por proporcionar el plásmido pKK30. Agradecemos a Tiffany Zarrella por secuenciar y ensamblar los genomas de los aislamientos clínicos, así como por su asistencia con la tipificación de SCCmec. Agradecemos a Susan Gottesman, Gigi Storz, John Dekker y a los miembros del laboratorio de Khare por sus comentarios sobre el manuscrito, y a los miembros de los laboratorios de Gottesman, Ramamurthi y Khare por el debate y las sugerencias a lo largo de este trabajo. Este estudio utilizó los recursos computacionales del grupo Biowulf de computación de alto rendimiento de los NIH (http://hpc.nih.gov). Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación Intramural de los NIH, el Instituto Nacional del Cáncer y el Centro para la Investigación del Cáncer.

Financiamiento de acceso abierto proporcionado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH).

Laboratorio de Biología Molecular, Instituto Nacional del Cáncer, Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MD, 20892, EE. UU.

Kalinga Pavan T. Silva, Ganesh Sundar y Anupama Khare

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GS realizó los experimentos de evolución originales, KPTS realizó todos los demás experimentos, KPTS y AK analizaron los datos y escribieron el manuscrito, AK supervisó la investigación.

Correspondencia a Anupama Khare.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Tobias Bollenbach, Theresa Fink y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Silva, KPT, Sundar, G. & Khare, A. Las amplificaciones del gen de la bomba de eflujo eluden la necesidad de múltiples mutaciones objetivo para la resistencia contra el antibiótico de doble objetivo. Nat Comun 14, 3402 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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Recibido: 07 Diciembre 2022

Aceptado: 05 mayo 2023

Publicado: 09 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-38507-4

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